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改写教科书:利用基因修饰小鼠发现第四层脑膜SLYM!

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脑膜是覆盖大脑和脊髓的膜状结缔组织的分层单元。这些覆盖物包住中枢神经系统结构,以便它们不直接接触脊柱或头骨的骨骼 。传统三层脑膜理论认为:中枢神经系统由硬脑膜、蛛网膜和软脑膜分隔。

之前学者们认为,蛛网膜与软脑膜之间存在一个称为“蛛网膜下腔”的较大空间。今年Maiken Nedergaard研究团队颠覆性地发现了在蛛网膜下腔中存在一种特殊的淋巴样膜,形成了大脑的第四层脑膜结构,被称为蛛网膜下腔淋巴样膜(Spider-Like Lymphatic Membrane,SLYM),它在物质交换和免疫监视方面发挥着关键作用。这一发现重新定义了大脑脑膜系统,其研究成果发表于Science科学杂志[1]。

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Maiken Nedergaard团队主要利用了Prox1-EGFP+报告小鼠(即Prox1表达处同时表达增强型绿色荧光蛋白)进行相关实验,探索了大脑周围的SLYM内脑脊液和免疫细胞运输的组织方式。

研究人员通过体内双光子显微镜观察Prox1-EGFP+小鼠体感皮层,发现在胶原束下方存在一层扁平的Prox1-EGFP+单层细胞,与松散的胶原纤维混合在一起,形成了SLYM。进一步的分析表明,SLYM的厚度约为14.2微米,覆盖着蛛网膜下腔的血管,而硬脑膜的平均厚度为21.8微米,被胶原纤维包围。这表示,二者在结构上有明显的差别。

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图1 活体成像显示第四脑膜层

此外,全脑结构分析显示,SLYM与静脉窦内皮细胞直接相连,为静脉窦壁上的蛛网膜下腔绒毛样结构。在人类皮层组织中也发现了SLYM存在于整个蛛网膜下腔。

为确定SLYM是否构成一种不渗透的膜,研究者们通过在Prox1-EGFP+小鼠SLYM两侧注射红色荧光微球和蓝色荧光微球,发现这些荧光团并没有相互渗透。而渗透性实验显示SLYM不允许3kDa及以上分子通过,这表明,SLYM是一种屏障,将蛛网膜下腔分成上浅表层和下深层两个腔室,限制了大多数肽和蛋白质(如β-淀粉样蛋白和tau)在上下蛛网膜下腔间的交换。

图2 SLYM代表将蛛网膜下腔空间细分为两个隔室的屏障.png

图2 SLYM代表将蛛网膜下腔空间细分为两个隔室的屏障

免疫组织化学染色实验表明,SLYM中的Prox1-EGFP+细胞也表达了其他淋巴标记物PDPN和细胞维A酸结合蛋白2(CRABP2),表明SLYM与淋巴系统有关。进一步的免疫荧光结果显示,SLYM不表达蛛网膜屏障细胞层的主要成分CLDN-11,也不表达蛛网膜小梁的标志物淋巴管内皮受体1(LYVE1)。这些结果表明,SLYM是单层组织膜结构而不是管状结构,并且它表现出一组独特的淋巴标记。

研究人员还通过双光子显微镜观察到SLYM中存在大量的白细胞,而在腹腔注射脂多糖后,SLYM中的白细胞聚集明显增加,这种异常聚集也在老年小鼠中观察到。此外,SLYM中还存在巨噬细胞和树突状细胞,表明SLYM是一个关键的免疫细胞微环境。

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图3 SLYM拥有大量髓系细胞

这项研究的重大发现表明,在小鼠和人类大脑中,都存在着第四层脑膜——SLYM。它包裹着血管并与静脉窦内皮紧密相连,允许脑脊液和静脉血进行物质交换;与此同时,SLYM也是免疫发挥作用过程中的重要角色,为我们了解大脑的免疫功能和液体运输功能提供了崭新的视角。

在该研究中,Maiken Nedergaard团队利用Prospero相关同源异形盒蛋白1(Prox1)作为标记淋巴管内皮细胞标志物,其灵感或许来源于该团队在2012年发现的胶质淋巴通路,以及2015年脑膜淋巴管的发现。

Prox1是一种高度保守的、决定淋巴命运的转录调节因子,有助于淋巴管的形成。它在中枢神经系统、晶状体、视网膜、肝脏、胰腺和心脏等器官的发育中发挥关键作用,并且被认为是淋巴系统的主调节分子。

此外,随着越来越多的证据表明Prox1也与多种癌症的发生有关。Prox1可通过miR-9使E-钙粘素下调来促结肠癌发展;在肝细胞癌病例中,它是一种抑癌基因,能抑制促转移转录因子TWIST1的转录。Prox1表现出重要的肿瘤抑制和肿瘤增强特性,这取决于肿瘤的起源器官[2]。 

随着研究的发展,或许从前许多关于大脑的固有认知都将被改写。

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南模提供良好的验证数据:

Prox1-IRES-CreERT2与报告基因小鼠杂交获得Prox1-CreERT2/+;Rosa26-tdTomato/+小鼠,经tamoxifen处理后,在海马齿状回部位实现特异性表达。

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Fig1. CreERT2-mediated recombination in Dentate Gyrus of Prox1-CreERT2/+;Rosa26-tdTomato/+ mouse.

也能在眼、心脏、肾脏、胰腺、脾脏、等多种器官中实现PROX1的时间特异性表达。

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Fig2. Detection of tdTomato(red) in various tissues of Prox1-CreERT2/+;Rosa26-tdTomato/+ mice. Labeling was also observed in pituitary gland, retina, heart, thymus, stomach, lung, submandibular gland, muscle, ovary, spleen, pancreas and kidney.

参考文献

[1] Møllgård K, Beinlich FRM, Kusk P, Miyakoshi LM, Delle C, Plá V, Hauglund NL, Esmail T, Rasmussen MK, Gomolka RS, Mori Y, Nedergaard M. A mesothelium divides the subarachnoid space into functional compartments. Science. 2023 Jan 6;379(6627):84-88. doi: 10.1126/science.adc8810.

[2] Ntikoudi E, Pergaris A, Kykalos S, Politi E, Theocharis S. The Role of PROX1 in Neoplasia: A Key Player Often Overlooked. Diagnostics (Basel). 2022 Jul 4;12(7):1624. doi: 10.3390/diagnostics12071624.

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