编者：1988 年《实验动物管理条例》发布实施，在实验动物工作规范化、法制化管理，保障实验动物和动物实验的质量，推动我国科技发展和民生保障等方面发挥了重要作用。特别是在实验动物标准体系的完善、质量检测网络的建设、质量检测机构能力的提升、质量检测技术的研究、质量检测工作的展开等方面，取得了长足的进步与发展。

质量管理是实验动物管理的核心和切入点。在质量管理方面，标准是依法管理的科学依据，许可证制度是依法管理的主要措施，而质量监测则是标准能够得以落实、许可证制度得以实施的技术支撑条件保障。建立实验动物质量监测网络，依法开展实验动物质量检测，为科学监管提供依据。

为此，借“科技资讯”之窗，陆续介绍我国实验动物质量检测与评价领域所开展的工作及取得的成果。

一、课题提出的背景与意义

作为科技条件资源，实验动物是引领生命科学研究和发展的重要支撑保障条件，是生命科学和生物技术创新的基础。质量标准化是实验动物得以应用的基本前提，实验动物质量决定着生命科学等领域研究工作的质量和水平。随着生命科学和生物技术快速发展，突显对标准化实验动物的迫切需求，特别是国家重大疾病防治与新药创制战略的实施，以及国际科技交流的不断增长，实验动物标准体系的不完善，实验动物质量标准化水平等问题也逐渐暴露出来。

农用实验动物牛、羊、鸭、猫、水貂、猪、马等，国家并没有相应的标准。标准的缺失造成了我国大量非标准化的实验用动物应用于教学、科研、生产及药品检定，造成了一定的经济损失和社会危害。因此我国亟需建立相关农用动物实验动物化的标准及检测方法。

与国际发达国家相比，国内实验动物检测项目仍然落后于发达国家，随着全球一体化的发展，国内实验动物质量检测标准及相应检测方法已经和国际相关标准存在一定的差距，也使得一些病原微生物因我国标准过低而随着动物引进带入国内。因此，结合我国实际情况，完善实验动物质量检测标准，相应增加检测项目，逐步与国际相应标准接轨十分必要。

近年来，随着病原微生物检测技术的突飞猛进，目前实验动物相关检测方法亟待改进，以提高检测结果的科学性与准确性。抗原蛋白超灵敏检测技术，基因芯片检测技术，多重 PCR/荧光定量 PCR 检测等技术近几年获得了较大的发展，已经应用于检测领域并有相关试剂盒产品问世，但在实验动物质量检测领域并未应用，实验动物质量检测效率有待提高，亟需建立多种病原微生物的联合、快速的检测方法。

在实验动物科学发展水平较高的一些国家，商品化、系列化的检测试剂盒已较为成熟。这些试剂盒的应用， 极大地满足检测工作的需要，检测工作的质量也得到了保证。虽然从国外可以买到部分商品化供应的试剂盒， 但价格昂贵，对我们来讲不是解决检测试剂来源的一个切实可行的途径。为实施实验动物许可证管理制度和我国系列实验动物质量标准，加强实验动物工作的法制化和科学化管理，促进实验动物质量提高，充分发挥实验动物质量检测在保障实验动物质量中的作用，研制标准化的检测试剂盒已成为当务之急。

本项目选择常用实验动物、新培育实验动物、拟实验动物化农用动物等病原微生物及寄生虫检测技术为研究对象，以实验动物质量检测方法研究为主题，力争在 3-5 年内实现我国实验动物质量检测试剂的标准化。建立实验动物新品种的病原微生物和寄生虫检测技术,实验动物新发传染病病原微生物和寄生虫检测技术, 应用新技术改进与完善现有实验动物传染病病原微生物和寄生虫检测方法，参考国际先进标准建立实验动物传染病病原微生物和寄生虫检测方法，建立质量检测新方法评价标准及评价技术平台，推进实验动物传染病病原微生物检测试剂的注册与产业化开发。弥补我国现有实验动物质量检测试剂种类不多、质量不高、制备不规范、评价不全面、针对性不强等不足，丰富和完善现有实验动物质量检测方法，促进实验动物资源的开发利用，进而推动生命科学领域的研究与发展。

二、课题研究任务的主要内容及任务分工

（一）实验用动物新品种的病原检测技术研究与应用

1.实验用猫病原检测技术研究与应用：建立 4 种猫易感病毒病原体（泛白细胞减少症病毒、猫疱疹病毒、猫免疫缺陷病毒、猫杯状病毒）的 ELISA 或胶体金等检测方法。建立 2 种猫细菌检测方法。猫螺杆菌 LAMP 检测方法，猫巴尔通体荧光定量 PCR 检测方法。建立猫弓形虫 ELISA 检测方法。 在此基础上，研究制定实验用猫微生物学和寄生虫学等级标准（研究稿）及检测技术规程（研究稿）。

承担单位分工：吉林大学，中国食品药品检定研究院负责检测方法及标准的建立工作，河北医科大学负责 检测方法的实验验证工作。

2.实验用牛病原检测技术研究与应用：建立 3 种实验用牛易感病毒病病原体检测方法，包括疯牛病 qPMCA 检测方法，牛传染性鼻气管炎病毒荧光 PCR 检测方法，牛病毒性腹泻快速 RT-PCR 检测方法。建立 2 种实验用牛的易感细菌病病原体检测方法，包括：牛布鲁氏菌 PCR 检测方法、LAMP 检测方法，牛结核病双抗体夹心 ELISA 早期诊断方法。建立实验用牛人兽共患寄生虫牛肠道原虫（隐孢子虫、贾第虫等）多重快速鉴别 PCR 检测方法。在此基础上，研究制定实验用牛微生物学和寄生虫学等级标准（研究稿）及检测技术规程（研究稿）。

承担单位分工：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国农业大学、军事科学科学院野战输血研究所、内 蒙古大学和内蒙古农业大学负责相应的病毒及细菌检测方法及相关标准的制定工作，吉林大学负责寄生虫检测方法及相关标准的制定工作。内蒙古大学和内蒙古农业大学负责检测方法的验证和田间实验工作。

3.实验用羊病原微生物和寄生虫的检测技术研究与应用：建立 4 种实验用羊易感病毒病病原体检测方法， 包括：羊痒病 qPMCA 检测方法，蓝舌病病毒抗原、抗体 ELISA 检测方法，山羊痘和绵羊痘通用 PCR 检测方法及特异性鉴别多重 PCR 检测方法的建立。建立 1 种实验用羊的易感细菌病病原体检测方法。包括：羊布鲁氏菌OMP2 基因快速 PCR 检测方法、BCSP31 基因 LAMP 检测方法、多重 PCR 检测方法。建立实验用羊人兽共患寄生虫羊肠道原虫（隐孢子虫、贾第虫等）多重快速 PCR 鉴别检测方法。 在此基础上，研究制定实验用羊微生物学和寄生虫学等级标准（研究稿）及检测技术规程（研究稿）。

承担单位分工：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国农业大学、军事科学科学院野战输血研究所、内 蒙古大学和内蒙古农业大学负责相应的病毒及细菌检测方法及相关标准的制定工作，吉林大学负责寄生虫检测方法及相关标准的制定工作。内蒙古大学和内蒙古农业大学负责检测方法的验证和田间实验工作。

4.实验用 SPF 级鸭病原微生物和寄生虫的检测技术研究与应用：建立 3 种 SPF 鸭病毒的病原体检测方法， 包括：鸭肝炎、鸭瘟病毒、鸭圆环病毒分离鉴定及 PCR（RT-PCR）检测方法。建立 1 种 SPF 鸭细菌病病原体(李默氏杆菌或大肠杆菌) PCR 检测方法。建立 1 种 SPF 鸭球虫镜检及 PCR 检测方法。 在此基础上，研究制定 SPF 鸭微生物学和寄生虫学等级标准（研究稿）及检测技术规程（研究稿）。

承担单位分工：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所负责相应病毒、细菌检测方法及相关标准的制定工作， 吉林大学负责寄生虫检测方法及相关标准的制定工作。

（二）实验动物新发传染病病原的检测新技术集成创新与应用

1.实验动物新发传染病监测新技术研究与应用：小鼠新发传染病：小鼠 K 病毒、小鼠乳酸脱氢酶升高症病毒；地鼠新发传染病：汉坦病毒、小鼠肝炎病毒、猴病毒 5 和吐兰 H-a 病毒；犬传染病：狂犬病病毒、犬细小病毒、伪狂犬病毒、犬巴尔通体；猴新发传染病：猴泡沫病毒。

承担单位分工：中国食品药品检定研究院负责小鼠、地鼠新发传染病，猴泡沫病毒检测方法建立，中国农 业科学院哈尔滨兽医研究所负责犬传染病检测方法及标准的建立工作。

2.检测新技术集成创新与应用：分别建立猴 B 病毒、狂犬病病毒超灵敏抗原蛋白金纳米探针检测方法；建立小鼠病毒和细菌多重 PCR 检测方法；针对兔出血症病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒和传染性犬肝炎病毒构建假病毒表达系统；实验动物寄生虫诊断技术改进与完善，猴结核病检测技术改进与完善。

承担单位分工：军事科学科学院野战输血研究所负责超灵敏抗原蛋白金纳米探针检测方法建立，河北医科大学负责小鼠病毒细菌多重 PCR 检测方法建立，中国食品药品检定研究院负责实验动物中和抗体检测技术建立，吉林大学负责实验动物寄生虫诊断技术改进与完善，中国农业大学负责猴结核病检测技术改进与完善。

（三）实验动物疫病病原诊断试剂产业化关键技术开发与应用

1.新产品临床申报和注册：完成 4 种 SPF 鸡疫病病原/抗体检测试剂盒开发，并完成其中 2 种新产品临床申报和注册。2.新开发试剂盒产业化。

承担承担单位分工：动物用生物制品国家工程研究中心负责新检测试剂临床申报和注册工作，同时项目各 参加单位研发的成熟产品优先通过工程中心进行产业化开发。

三、课题研究要解决的关键技术难点

（一）实验用动物合格的阴性与阳性血清对照采集

虽然猫、牛、羊、鸭等已被用于科学实验，但国内并未建立标准化的实验用动物群体，因此，对这些动物所携带的病原微生物并不清楚，部分动物易感病原微生物对其自身危害小，但隐性携带率较高，阴性血清样本的获得较困难。筛选病原微生物阴性动物也是本项目的工作难点之一。同时，还应区分动物的自然感染与免疫后抗体升高的情况，从而获得合格的阴性与阳性血清对照，这是建立实验用动物病原微生物血清学检测的基础。

（二）检测用抗体特异性和亲和力

获得病原微生物高特异性和亲和力的病毒单抗是保证 ELISA 免疫学检测特异性和敏感性的关键，可通过筛选来获得符合检测标准的单抗，同时具备高特异性和效价的单抗可用于相应病原微生物的检测。

（三）引物及荧光探针特异性和敏感性

核酸检测探针以及 PCR 引物均是检测特异性和敏感性的关键因素，多重 PCR/荧光定量 PCR 反应体系较为复杂，在生物条形码检测技术研究中，除了要求具备高特异性和亲和力的单抗外，条形码 DNA 的荧光定量 PCR 检测也关系到检测的准确性。可利用生物信息学方法等设计和筛选核酸探针和 PCR 引物，优化实验设计以确保检测的特异性和敏感性。

（四）实验动物病原微生物检测试剂的注册与产业化

实验动物病原微生物检测试剂的开发，从技术层面分析，对所有的项目参加单位都不困难，但是将检测方法最终开发成商品化的检测试剂，需要有较长的过程。新兽药证书是检测试剂产品孵化、转化的必要条件，本项目吸收了动物用生物制品国家工程研究中心并主要承担实验动物疫病病原检测试剂产业化开发工作，借助其动物疫病检测制品 GMP 生产线及具有经验丰富经验的新兽药注册团队，快速推进新兽药的申报，全面提升项目成果转化、孵化能力，为项目成果的推广应用提供必要的保障，也为今后实验动物病原微生物检测试剂注册与产业化工作起到示范作用。

（五）实验用动物病原微生物标准毒株与菌种

建立实验用猫、牛、羊、鸭病原微生物检测方法，首先需要培养纯化标准毒株或菌种，在本研究需要建立的病原微生物检测技术中，绝大多数病原微生物，国内都已经分离了该毒的标准毒株，但猫的部分病毒病，国内并未分离出标准毒株，在前期研究工作中，项目组从 ATCC 引进了部分标准毒株，并进行了扩大培养。由于病毒存在较大的变异性，因此，在建立检测方法时，还需要将引进的标准毒株与国内分离的野毒株进行比较， 确保检测方法的准确性，特别是在建立 PCR 等基因水平检测方法时，应尽可能选取病毒 N 蛋白等保守序列作为检测目的片段，以保证检测结果的准确性。

（六）实验用动物病原微生物检测中组织分布丰度的确定

实验用猫、牛、羊、鸭筛选出合适的病原学检测方法也多有不同，每种重大疫病在动物体内的感染发病机制不尽相同，特别是新发感染性疾病病原，面临的第一个问题是疫病发生模式，不同疫病病原在动物体内不同组织分布丰度（组织嗜性）不同，因此同一来源样品（如肝脏样品或血清样品）针对多种疫病病原检测的敏感性不尽相同，建立多种重大疫病病原学联合鉴别检测方法时需确定合适采样部位。

（七）生物安全问题

本项目所涉及的牛海绵状脑病、羊痒病、蓝舌病等为国家规定的一类动物疫病，需要在动物生物安全三级以上实验室开展相关研究工作，申请单位虽都已经具备相应实验室，但在研究工作中仍需避免病原微生物的泄露，同时，应加强对实验室及参与研究工作的研究生进行培训，严防病原微生物对实验人员产生危害。

四、课题研究取得的成果

课题组经过三年的联合攻关，紧紧围绕实验用动物病原分子生物学快速检测新技术研究与应用这一领域开展了深入系统的研究，主要对实验用动物新品种的病原检测技术研究与应用、实验动物新发传染病病原的检测新技术集成创新与应用、实验动物疫病病原诊断试剂产业化关键技术开发与应用方面开展研究工作。

（一）实验用动物新品种的病原检测技术研究与应用

建立了猫疱疹病毒Ⅰ型 PCR 检测方法、抗体 ELISA 检测方法；猫疱疹病毒Ⅰ型抗体 ELISA 检测方法的；猫细小病毒 PCR 检测方法的建立；猫细小病毒和猫疱疹病毒 I 型荧光定量 PCR 检测技术；猫细小病毒和猫疱疹病毒 I 型环介导等温扩增检测技术；猫杯状病毒胶体金及 ELISA 检测试纸条；猫沙门氏菌的分离鉴定及 PCR 检测技术；猫螺杆菌 LAMP 检测方法；猫嗜肺巴斯德杆菌的分离鉴定及 PCR 检测技术；猫巴尔通体实时荧光定量PCR 方法检测方法；猫弓形虫间接 ELISA 检测方法；猫弓形虫 Dot-ELISA 检测方法。实验用猫共计建立了 8 种病原体的 16 种检测方法。所建立的检测方法灵敏、特异、重复性好。

建立了实验用猫病原微生物和寄生虫质量控制地方标准，完善了实验用猫标准化体系。

建立了实验用牛、羊布鲁氏菌 PCR 和 LAMP 检测方法；实验用牛、羊布鲁氏菌胶体金检测试纸条；牛病毒性腹泻-黏膜病病毒实时荧光定量 PCR 方法；羊传染性脓疱实时荧光定量 PCR 方法；牛传染性鼻气管炎病毒双重基因 PCR 检测方法；牛支原体 PCR 检测方法；实验用牛的疯牛病、羊的羊痒病 qPMCA 技术检测方法；牛病毒性腹泻抗原、抗体 ELISA 检测方法；牛结核病双抗体夹心 ELISA 早期诊断方法；山羊痘和绵羊痘 PCR 检测技术； 山羊痘和绵羊痘病毒 qPCR 检测方法；羊蓝舌病病毒抗原、抗体 ELISA 检测方法；实验用牛十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫与安氏微小隐孢子虫三重 PCR 检测方法；实验用羊贾第虫与隐孢子虫双重 PCR 检测方法。实验用牛共计建立了 17 种病原的 18 种检测方法。所建立的检测方法灵敏、特异、重复性好。

建立了实验用牛、羊的病原微生物和寄生虫质量控制地方标准，完善了实验用牛、羊标准化体系。

建立了实验用 SPF 级鸭鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒病原分离鉴定方法；鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒二重 PCR 检测方法；鸭圆环病毒 PCR 检测方法的建立；禽致病性大肠杆菌多重 PCR 检测方法；鸭球虫 PCR 检测方法。实验用SPF 鸭共计 5 种病原 6 种检测方法。所建立的检测方法灵敏、特异、重复性好。

建立了实验用 SPF 级鸭的病原微生物和寄生虫质量控制地方标准，完善了实验用 SPF 级鸭标准化体系。

（二）实验动物新发传染病病原的检测新技术集成创新与应用

建立了小鼠 k 病毒 PCR 检测方法；猴泡沫病毒（SFV）RT-nestPCR 检测方法；猴泡沫病毒血清学检测方法； 猴副流感病毒 PCR 检测方法；大、小鼠多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、肺支原体和肺炎克雷伯杆菌实验动物病原体多重 PCR 检测方法；小鼠金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌和肺支原体多重PCR 检测方法；大鼠细小病毒 H-1 株 PCR 检测方法；大鼠冠状病毒、仙台病毒的多重 PCR 检测方法。共计建立了 15 种病原的 8 种单项或多重检测方法。

建立了猴 B 病毒、狂犬病病毒的超灵敏抗原蛋白金纳米探针检测技术；猴 B 病毒和人疱疹病毒鉴定技术； 小鼠肝炎病毒（MHV）RT-PCR 检测方法；狂犬病病毒 RT-PCR 和荧光定量 PCR 检测方法；犬细小病毒 PCR 及荧光定量检测方法；犬伪狂犬病毒 PCR 及荧光定量检测方法；犬嗜血巴尔通体 PCR 及荧光定量检测方法；犬瘟热病毒（CDV）假病毒系统；犬细小病毒（CPV）假病毒；犬腺病毒 2 型病毒假病毒；兔出血症病毒假病毒；鼠毛滴虫巢式 PCR 检测方法；兔艾美尔球虫巢式 PCR 检测方法。共建立了 13 种病原的 19 种检测新技术。

共计建立了 15 种病原的 8 种单项或多重检测方法。共建立了 13 种病原的 19 种检测新技术。

以上所建立的检测方法灵敏、特异、重复性好。

（三）实验动物疫病病原诊断试剂产业化关键技术开发与应用

完成禽白血病群特异性抗原 ELISA 检测试剂盒；鸡传染性法氏囊病病毒 ELISA 抗体检测试剂盒；鸡传染性法氏囊病病毒琼脂扩散抗原、及阴阳性血清；禽白血病病毒群特异抗原检测试纸条的产业化开发。新开发鸡传染性支气管炎病毒 ELISA 抗体检测试剂盒 1 项，预计后续也将申报新兽药临床试验。

课题执行过程中，共申请国家发明专利 10 件，授权 4 件；获新兽药证书 2 项；发表论文 54 篇，其中SCI 收录文章 20 篇；制定并颁布实验用猫微生物、寄生虫吉林省地方标准 2 项；培养硕士研究生 16 名、博士研究生 5 名、博士后 2 名；完成实验动物从业人员教材 2 部，组织全国实验动物质量检测技术培训 2 次，培训相关检测人员 150 人次。

最终完成了任务书中规定的各项研究内容和考核指标。五、快检技术在我国实验动物病原学检测中应用的展望实验动物是引领生命科学研究和发展的重要支撑保障条件，是生命科学和生物技术创新的基础。质量标准化是实验动物得以应用的基本前提，实验动物质量决定着生命科学等领域研究工作的质量和水平。虽然经过课题组 3 年不懈努力，建立了一批实验动物质量检测方法新方法，新技术，新试剂，但是距离我国目前实验动物质量检测的需要仍有不小的差距。

（一）实验用动物方面还有很长的路要走

针对实验用动物新品种质量控制方面本课题由于不断的前期组合，包含了 4 个新的实验用动物新品种（猫， 牛，羊，鸭），虽然各个单位在不同的领域存在各自的优势，但是由于各个新品种的研究基础不同，实验动物标准化程度不同，群体规模也不同，本课题虽然很好的整合了各个参加单位的优势力量，集中攻关，但研究内容过于繁杂，难免会造成重此轻彼的情况，各个物种进度很难协调一致。未来科技主管部门在以后的课题顶层设计过程中，应突出单一物种，逐个重点攻关，这样更能高效的解决我国实验动物标准化所面对的问题。

（二）检测方法标准化程度不高，推广应用时间不足

各个课题组建立的试剂盒和检测试剂的制备以基本完成，部分专利也进入了申报阶段，部分试剂盒也进入报批阶段。但是试剂盒和检测方法的推广应用未的到充分的开发，相关检测标准的制定和颁布略显落后。各个课题承担单位应进一步对所建立的试剂盒及检测方法进行标准化开发，进一步制定相应的检测标准，将所建立的检测方法进行充分的推广应用实践，更好的为科研生产服务。