图1 CAND1在NAFLD患者,HFD小鼠和PA诱导的肝细胞中低表达[[1]
研究人员在NAFLD患者和正常供者的肝活检样本中检测了CAND1的表达水平。与正常供体相比,NAFLD患者肝脏组织中CAND1 mRNA和蛋白质含量降低。与对照组相比,HFD喂养后小鼠肝脏中CAND1 mRNA和蛋白质水平也显著降低。此外,AML12和THLE-2细胞暴露于棕榈酸(PA)24小时后,CAND1 mRNA和蛋白质水平也显著降低,这些结果表明,CAND1在NAFLD的发展中起着合理的作用,如图1所示。
图2 肝细胞特异性CAND1缺乏加剧了雄性小鼠hfd诱导的肝损伤[1]
为了验证CAND1对肝细胞的特异性作用,研究人员使用赛业生物提供的CAND1flox/flox小鼠与Alb-cre工具鼠杂交构建了肝细胞特异性CAND1敲除(条件敲除,cKO)雄性小鼠。值得注意的是,在HFD治疗后,WT和CAND1 cKO小鼠的食物摄入量没有统计学差异。HFD处理增加了16周后WT和CAND1 cKO小鼠的体重和附睾脂肪重量,WT-HFD和CAND1 cKO-HFD小鼠的体重和附睾脂肪重量相当。CAND1 cKO-HFD小鼠的LB/BW比增加。与WT-HFD小鼠相比,CAND1 cKO-HFD小鼠的TG和TC水平显著升高。H&E和油红O染色显示,CAND1 cKO-HFD小鼠肝脏中的脂质积累比WT-HFD小鼠更严重。CNAD1 cKO-HFD小鼠表现出更高的空腹血糖、胰岛素浓度和HOMA-IR。此外,与WT-HFD小鼠相比,CAND1 cKO-HFD小鼠表现出更强的葡萄糖耐量和胰岛素敏感性。肝脏炎症是NAFL发展为NASH的常见病理改变。与WT-HFD小鼠相比,CAND1 cKO-HFD小鼠肝脏中促炎因子的表达增加。然而,WT-HFD和CAND1 cKO-HFD小鼠的纤维化面积和血清αFP(肝癌标志物)水平没有差异。这些发现表明肝细胞中CAND1缺乏加重了hfd诱导的肝损伤,如图2所示。
图3 肝细胞特异性CAND1过表达改善雄性小鼠hfd诱导的肝损伤[1]
研究人员进一步使用赛业生物提供的CAND1knockin小鼠与Alb-cre工具鼠杂交建立了肝细胞特异性CAND1过表达(条件敲入,cKI)雄性小鼠系,以验证肝细胞CAND1对HFD治疗后肝损伤的功能。HFD或NC治疗后,WT与CAND1 cKI小鼠的进食量无统计学差异。HFD治疗在HFD治疗16周后增加了WT和CAND1 cKI雄性小鼠的体重和附睾脂肪重量,WT-HFD和cKI-HFD小鼠的体重和附睾脂肪重量相当。与CAND1 cKO小鼠的变化相反,肝细胞特异性过表达CAND1在很大程度上保护了HFD诱导的肝脂肪变性、肝抵抗和炎症。具体而言,肝细胞中CAND1的过表达改善了肝脂肪变性,降低了LW/BW比和肝脏中TG和TC的含量。与WT-HFD小鼠相比,CAND1 cKI-HFD小鼠的糖耐量和胰岛素敏感性显著提高。此外,CAND1 cKI-HFD小鼠的促炎因子mRNA水平低于WT-HFD小鼠。天狼星红染色显示WT-HFD和cKI-HFD雄性小鼠的纤维化面积没有差异。这些数据证实了CAND1在hfd诱导的肝损伤中的保护作用,如图3所示。
图4 CAND1控制脂肪酸β-氧化基因ACAA2的泛素化降解[1]
图5 CAND1抑制Cullin1、FBXO42和ACAA2复合物的形成[1]
CAND1通过调节含有底物受体的F-box和Cullin1复合物的组装来控制全局CRLs网络的动力学。为了阐明CAND1调控NAFLD发展的机制,研究人员进行了Co-IP和质谱分析,以鉴定转染NC或siCAND1的PA处理的L02细胞中的cullin1结合蛋白。共获得72个解除调控的cullin1结合蛋白,其中39个基因上调,33个基因下调。在上调基因中,乙酰辅酶A酰基转移酶2(ACAA2)和F-box蛋白42(FBXO42)引起了研究人员的注意。ACAA2是一种脂肪酸β氧化的硫解酶,其过表达可促进脂肪酸氧化并抑制脂质积累。F-box蛋白FBXO42是一种底物受体,可招募靶蛋白并促进其泛素化降解。他们推测Cullin1、FBXO42和ACAA2可能形成一个SCF复合物,调节ACAA2的泛素化和降解,从而影响CAND1对NAFLD的作用。分子对接也预测了FBXO42与ACAA2和Cullin1结合。
研究人员检测了Cullin1、FBXO42和ACAA2复合物在AML12和THLE-2细胞中的形成。PA处理后siCAND1中ACAA2、Cullin1和FBXO42复合物的形成较NC组明显增加,PA处理后siCAND1中ACAA2蛋白表达较NC组明显下调。
与WT小鼠相比,WT-hfd小鼠的ACAA2蛋白表达明显降低。与WT-hfd小鼠相比,CAND1 cKO-HFD小鼠的ACAA2蛋白显著降低,表明ACAA2泛素化程度较高。CAND1 cKI-HFD雄性小鼠的ACAA2蛋白显著上调,泛素化水平明显降低。
接下来,研究人员用Co-IP法检测Cullin1、FBXO42和ACAA2复合物。与WT小鼠相比,WT-hfd小鼠中ACAA2、Cullin1和FBXO42复合物的形成明显增加,且CAND1 cKO-HFD中ACAA2、Cullin1和FBXO42复合物的含量高于WT-hfd小鼠。然而,与WT-HFD小鼠相比,CAND1 cKI-HFD小鼠中ACAA2、Cullin1和FBXO42复合物的含量较少。这些结果表明,CAND1抑制ACAA2、Cullin1和FBXO42复合物的组装,从而抑制ACAA2的泛素化降解,如图4,5所示。
图6 ACAA2过表达可改善因CAND1缺陷增强的雄性小鼠肝脂肪变性、胰岛素抵抗和炎症[1]
为了进一步阐明CAND1对NAFLD的调节作用是否由ACAA2介导,研究人员通过尾静脉向雄性小鼠注射AAV8-ACAA2病毒,特异性提高了ACAA2在肝细胞中的表达。ACAA2过表达大大改善了CAND1 cKO-HFD小鼠的病理改变,包括LB/BW比、肝脏TG和TC水平以及脂质积累。此外,ACAA2过表达显著消除了CAND1条件敲除对饲喂HFD小鼠的空腹血糖、空腹胰岛素和HOMA-IR指数的加重作用。此外,ACAA2过表达改善了CAND1 cKO-HFD小鼠的葡萄糖耐量和胰岛素敏感性,这一点通过腹腔注射GTT和ITT得到了证明。ACAA2过表达也降低了CAND1 cKO-HFD小鼠中促炎因子IL-6、TNF-α和TLR-4的水平。这些结果表明,肝细胞CAND1对NAFLD进展的影响是由ACAA2介导的,如图6所示。
图7 肝细胞特异性CAND1敲除促进雄性小鼠饥饿诱导的脂肪肝[1]
在禁食条件下,过量的脂肪酸被重新酯化成甘油三酯,在肝脏细胞内储存,从而导致饥饿性脂肪肝。然后,研究人员探讨了CAND1是否也对饥饿诱导的脂肪肝有调节作用。在雄性小鼠饥饿24h后,他们检测了肝脏脂质的积累。结果显示,与WT小鼠相比,CAND1 cKO雄性小鼠饥饿后肝脏脂质积累更为严重。CAND1 cKO雄性小鼠肝脏中TG和TC水平也显著升高。此外,CAND1 cKO中ACAA2水平显著降低。这些数据表明,CAND1也抑制饥饿诱导的肝脏脂质代谢,如图7所示。
图8 雄激素/雄激素受体(AR)信号调控CAND1的转录[1]
由于NAFLD肝脏中CAND1的mRNA水平降低,他们随后探索了CAND1的转录调控。研究人员使用JASPAR网站预测了CAND1基因的转录因子,并在CAND1基因的启动子区域确定了四个雄激素受体(AR)的潜在结合位点。他们观察到NAFLD雄性小鼠与正常鼠相比睾酮和AR水平下降。PA诱导后AML12细胞中AR表达也下降。有趣的是,与WT雄性小鼠相比,CAND1 cKO雄性小鼠的AR表达和睾酮水平显著降低。
为了阐明AR对CAND1转录的直接影响,研究人员将AR过表达质粒和含有顺序截断的CAND1启动子的质粒共转染到细胞中。在CAND1启动子区域鉴定了四个推测的AR结合位点。这些结合位点的序列缺失表明,ar结合位点1是ar促进CAND1转录活性的主要位点。此外,睾酮处理上调了AML12细胞中CAND1的mRNA和蛋白水平。pa诱导的脂质积累在siCAND1组和siAR组相似。在AML12细胞中,与单独敲低CAND1相比,AR和CAND1的同时敲低加重了PA诱导的脂质积累,而在PA处理后,CAND1的过表达减轻了AR缺陷引起的AML12细胞中的脂质积累。研究人员给雄性小鼠服用AR拮抗剂enzalutamide(10mg/kg),发现CAND1 mRNA和蛋白水平显著降低。并且,小鼠出生后2-6个月肝脏中CAND1水平升高,12个月时下降,这与AR的表达变化一致。这些结果表明,CAND1的转录受雄激素受体的调节,如图8所示。