更新时间：2019-01-22, 来源：国家实验动物专家委员会简报 2019年第6期2062

与基因工程小鼠等动物制备相比，遗传修饰NHP动物存在制备效率、操作难度、研究成本等多个瓶颈。以至于致在转基因小鼠出生后近20年后，才获得世界上首例绿色荧光蛋白转基因猴[23]。但是，ZFNs、TALENs和CRISPR/cas9等高效基因编辑技术的成熟和应用，促使NHP基因编辑动物制备进入了快车道，亨廷顿舞蹈病、帕金森病、抑郁症等NHP疾病动物模型相继诞生[24,25]。

但是，对糖尿病而言，目前尚无相关NHP基因工程动物制备的研究报道。我们认为，制备基因工程NHP糖尿病模型动物可能存在以下几方面限制：一是临床发现，90%以上2型糖尿病患者表现为基因表达改变而非基因编码改变[26-28]，虽然已证实某些T2DM患者的单基因突变是致病原因，但点突变患者在T2DM发病人群中的比例较低，因而基于该突变位点制备的基因工程动物在临床上的代表性存疑；二是人们利用全基因组关联分析（Genome-wide association studies, GWAS）在T2DM上发现了100多个关联SNP[26-28]，显然要对如此多的DNA位点进行遗传操作，目前还存在技术困难。此外，灵长类动物的世代间隔长（5~6年），且为单胎，即使获得了能稳定遗传的糖尿病模型小样本，按照小鼠模型培育需要8~10代[29]计算，种群培育的漫长周期，使得该途径的可行性和实用性也大受影响。

（四）糖尿病易感NHP种群的筛选和建立

临床流行病学调查发现，对于糖尿病遗传家族人群，如果合理饮食及运动，可能减少疾病发生；相反，非糖尿病敏感人群，如果长期摄入高糖、高脂食物，且不注意运动等活动，也可能增加患病风险。也就是说，糖尿病是遗传因素和环境因素共同作用的结果[26-28]。根据糖尿病的上述特征，目前培育的糖尿病模型动物种群（如kkay小鼠、DZF大鼠等）主要通过表型选育获得。

正如前面上述，NHP自然发病动物多为中老年，且兼具世代间隔长和单胎等特点，表型选育难以形成稳定遗传的种群。

最近，我们实验室利用人T2DM的遗传数据，通过生物信息学挖掘——基因组映射——特定靶点高通量测序这一崭新途径，获得了猴T2DM关联SNP；建立了猴T2DM遗传风险评估模型；筛选建立了T2DM易感猴繁育种群。

首先，利用人T2DM的遗传数据，通过生物信息学分析，挖掘到可能人T2DM关联的基因组片段276个，将其映射到食蟹猴基因组。采用均衡病-健小样本（82/85）对上述特定靶点进行高通量测序，得到与T2DM关联的SNPs共99个。利用99个关联SNPs建立猴T2DM遗传风险评估模型，模型的预测结果与动物实际表型一致性为79.64%（133/167）；而以关联程度最高的30个SNPs进行T2DM风险评估，其结果与99个SNPs基本一致。

进一步对两种遗传预测模型的风险系数进行统计分析，结果发现，当风险系数在0.4~0.6之间时，预测结果与动物实际表型差异较大（一致性约为62%~65%）；而当风险系数≤0.4或者≥0.6时，预测结果与动物实际表型的一致性显著提高（大于80%）。基于上述统计结果，我们提出了T2DM易感猴的评价标准为：对99个SNPs位点进行测序，当99-SNPs和30-SNPs的风险系数同时≥0.6，该动物为T2DM易感个体；当两种模型获得的风险系数同时≤0.4，该动物为T2DM不敏感个体。利用该标准对所测试的167只猴进行分析，预测结果与实际表型的一致性超过85%。

最后，从所测试的表观正常猴中挑选T2DM高风险动物8只、中度风险动物6只（99-SNPs或30-SNPs的风险系数为0.4~0.6）和低风险动物13只，同时饲喂高能量饲料32 w。高风险动物在20 w左右开始出现高血糖表型，最终6只猴出现糖尿病病变（75.0%，6/8），1只猴虽然血糖值仍在正常水平，但糖耐量受损（12.5%，1/8），而另1只猴糖代谢正常（12.5%，1/8）；6只中度风险动物，1只出现糖尿病病变（16.7%，1/6），3只仅表现糖耐量受损（50.0%，3/6），2只动物糖代谢正常（33.3%，2/6）；而13只低风险动物，糖代谢全部正常。

目前，课题组测试了334只中青年繁殖猴，获得了86只（在猴群中的比例为25.75%）T2DM遗传高风险猴（即99-SNPs和30-SNPs风险系数同时≥0.6的动物）。其中雌性75只，雄性11只，根据雌雄动物SNP位点的基因型，86只T2D高风险猴组成了10个繁殖单元。

关联SNP研究以及遗传风险筛选为T2DM等复杂遗传性疾病NHP模型动物种群建立提供了新途径，但种群的遗传稳定性还需要后代表型分析支持。课题组将及时对T2DM敏感猴群的后代进行测试，以检验该方法的可靠性。

三、非人灵长类动物糖尿病模型种群的标准化研究

与人T2DM发病进程一样，NHP动物在疾病不同阶段展现不同特征，到疾病后期，因高糖损伤而导致的心脑血管系统、肾脏组织等综合症将直接威胁到动物生命。因此，猴群定期监测、饲养标准、发病动物护理是种群标准化研究的重要内容。

（一）NHP糖尿病模型种群监测

1、空腹血糖：尽管不断有T2DM新的诊断指标被报道，但空腹血糖值仍然是糖尿病最直接的诊断标准。对人而言，WHO标准为：当空腹血糖≥7.0 mmol/L时为显性糖尿病；餐后2 h血糖值>7.8 mmol/L时，为糖耐量受损。

而猴子等NHP动物的血糖值目前尚无统一标准。对正常猴与健康人群的血糖值比较发现，NHP动物的血糖值通常较人低1.0~1.77 mmol/L。因此，猴的空腹糖>5.6 mmol/L时，即可能患病[30]。但也有研究报道认为，以人的指标（即空腹血糖≥7.0 mmol/L）作为猴糖尿病依据更准确[20]。

与人不同的是，动物的空腹血糖容易受操作过程影响。比如剧烈的保定操作以及麻醉剂都可能导致血糖值异常波动。对于猴子等NHP动物，目前主要采用两种方法确认动物的实际血糖值。一是不同时间点的测定结果比较；二是使用对血糖几乎没有影响的麻醉剂（如氯胺酮，剂量为10mg/kg体重）镇静后测试[31]。

另外，猴子等NHP动物的空腹时间也有别于人和其他动物。猴等NHP动物口腔两侧有颊囊结构，摄食时部分食物首先储存于颊囊中，然后在返回口腔咀嚼消化。因此，在测定猴子等NHP的空腹血糖时，动物禁食时间较人和无颊囊动物长[20]。

我们反复比较了猴的空腹血糖测定，获得了较为稳定的结果。程序如下：猴禁食（不禁水）13~14 h；用10mg/kg体重氯胺酮肌肉注射麻醉；15~20min后采后肢静脉血1.5~2.0mL；离心收集血清；在生化仪上测定血糖值。

此外，在测定动物血糖值时，经常用血糖试纸条测定全血。我们在实验中发现，全血的血糖值通常较血清低0.3~0.7mmol/L。

2、糖耐量试验：与血糖值相比，糖耐量试验被认为是糖代谢正常与否的金标准。在人上，糖耐量试验包括口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test，OGTT）和静脉注射葡萄糖耐量试验（intravenous glucose tolerance test，IVGTT）两种方式。

但对于NHP等动物而言，糖耐量试验主要采用IVGTT方法，以利于精确控制葡萄糖用量。我们对Bremer等[20]报道的方法进行了改进，即猴禁食13~14 h；肌肉注射麻醉氯胺酮10mg/kg体重；分别在麻醉剂注射后10~15min、20~25min采后肢静脉血两次，每次1.5~2.0mL；第二次采血后，同时静脉注射50%葡萄糖溶液1.2mL/kg体重；分别在葡萄糖注射后5、10、15、30、60、90、120、150min取后肢静脉血1.5~2.0mL；离心获得血清，测定血糖值和血清胰岛素。计算血清葡萄糖曲线下面积（Area under the curve of glucose tolerance test）、血清胰岛素曲线下面积（Area under the curve of blood insulin）、胰岛素敏感指数（insulin sensitivity index，ISI）。根据上述指标，可判定种群中不同动物所处的发病时期。

3、其他理化指标：除血糖和糖耐量试验外，对种群定期监测还包括以下指标：血清胰岛素、C反应蛋白、糖化血红蛋白、血脂（总胆固醇、HDL-C、LDL-C、TG、apoA1、apoB、apoC3等）、脂肪细胞激素（脂联素、瘦素等）、促炎标志物（CRP、MCP-1、PAI-1等分子）、体重（包括体重指数）、摄食量。虽然这些指标不是糖尿病的核心诊断标志，但可为动物的病程判定和划分提供有益帮助。

理论上，血清胰岛素、C反应蛋白和糖化血红蛋白对于糖尿病诊断有较高的价值和意义。但我们在猴研究中发现，血清胰岛素波动幅度太大，相反C反应蛋白和糖化血红蛋白又不敏感，不适合作为猴等NHP动物糖尿病的重要标志。

（二）NHP糖尿病模型种群饲养标准

高糖高脂饲料当前广泛应用于糖尿病模型动物制备，对于猴等NHP动物而言，目前已有商品化的高能量饲料。Bremer等[31]在饲喂商品化高能量饲料的同时，额外给予猴饮用含果糖（75g/天/只）的饮料，最终29只恒河猴饲喂一年后，4只猴发展成为显性糖尿病（空腹血糖值≥7.0 mmol/L），其余25只都表现代谢综合症的某些特征。

我们前期在T2DM遗传高风险猴的诱导实验中，根据动物营养需求、食物可口性、饲料坚硬度等指标，最终组成了如下高能量饲料配方：基础全价饲料55%；牛油25%；蔗糖7.0%；果糖7.0%；胆固醇1.0 %；酪蛋白3.0%；微量元素1.5%；复合维生素0.5%。利用该高能量饲料，动物最早在20 w即出现显性糖尿病表型（空腹血糖值≥7.0 mmol/L），饲喂32 w，8只T2DM遗传高风险猴有6只发展成为糖尿病。

而采用食物摄入量限制等措施，不仅延长了糖尿病猴的寿命，而且明显影响猴糖尿病的进程和并发症的发生。

这些研究表明，根据实际需求调整猴等NHP模型种群的饲料标准，既可减少动物本身的疾病痛苦，又能保证宝贵资源的最大利用。

（三）NHP糖尿病动物的护理

与人一样，猴等NHP动物一旦确诊为糖尿病，需要对发病动物进行精心护理，防止动物意外死亡，控制糖尿病性肾病、糖尿病性心血管系统疾病、糖尿病性眼病、糖尿病性周围神经病变等并发症。

Hansen等根据多年的研究结果，总结了一套糖尿病猴及其并发症的护理方案。其核心内容包括：（1）当猴首次被确诊为糖尿病时，动物体重将逐渐下降，此期如果不需要控制病情发展，动物不需要药物处理。（2）如果早期需要治疗，可给动物口服二甲双胍等、PPAR激动剂、吡格列酮等降糖；二甲双胍用量为500~1000mg/天/只，如果动物血糖值仍然处于高位，二甲双胍可加倍使用；二甲双胍通常可在一年或数年内能有效控制发病动物体重下降和并发症产生。（3）对于发病2~3年（也许时间更长）的动物，口服药物效果不佳，特别是动物出现高血糖（摄食后3~5 h血糖值超过160mg/dL）、体重急剧下降、尿糖和尿蛋白明显增加等临床表现时，可给予胰岛素治疗；最好选用长效胰岛素，初始剂量为1~2IU/只，也可根据动物的血糖控制情况，调整胰岛素用量。（4）当动物长期疾病而出现低血糖（35mg/dL）表现时，通常可能是因为使用了胰岛素，或者动物摄食量明显减少所致；护理上可通过提高食物和饮料的可口性增加动物摄食，也可通过胃管和静脉注射等方式补充葡萄糖，直到动物的血糖值达到120mg/dL以上；低血糖猴的治疗方案与患者完全相同，如果需要，甚至可给予胰高血糖素。