肺癌是全球癌症死亡的首要原因，其中肺腺癌是肺癌最常见的类型之一。肺腺癌具有复杂的病理亚型分类，不同阶段不同亚型的肺腺癌有着不同的预后。近年来，研究发现肺腺癌的发病率相对较高，且具有多发性等特点，这对肺腺癌的诊断和治疗有较大的挑战性。因此，为了进一步探究肺腺癌的进展过程，我们需要一个更加贴合人类肺腺癌进展过程的临床前模型来深入探讨肺腺癌的发生机制。

目前肿瘤临床前模型方法主要包括化学诱导、移植和基因编辑三大类别。其中基因编辑模型具有效率高，生存期长，在研究肿瘤发生转移及肿瘤微环境等方面发挥重要作用。通过CRISPR/Cas9等基因编辑工具，我们可以移除或植入某些特定的基因，从而激活动物形成肿瘤的模式。大鼠肉瘤（rat sarcoma，RAS）致癌基因是人类癌症中最常突变的癌基因，Kirsten大鼠肉瘤（KRAS）是最常见的突变RAS亚型。人类肺癌31%～35%发现了KRAS癌基因的激活突变。KRAS突变在肺腺癌中更常见（20%～40%），在鳞状NSCLC中较少见（约5%）。KRAS是一种与细胞膜相关的鸟苷三磷酸酶（guanosine triphosphatase，GTPase）信号蛋白，它调控细胞的增殖、分化和存活过程。超过80%的致癌 KRAS 突变发生在密码子12,其中甘氨酸残基被不同的氨基酸取代，导致 KRAS 突变肿瘤的基因组异质性。在肺癌中，KRAS 癌基因替换通常发生在外显子2的密码子12和13处，常见的密码子变体包含 G12C、G12D、G12V和G12A。

国际上应用最广泛的肺癌动物模型就是KRASLSL-G12D小鼠模型，通过与肺上皮细胞特异性的环化重组酶（Cyclization Recombination Enzyme，Cre）转基因小鼠杂交或用慢病毒或腺病毒递送Cre至肺组织内来实现KRAS突变体的激活，从而导致肺癌的发生。KRASLSL-G12D中致癌KRAS突变的表达由一个可移动的转录终止元件Lox-Stop-Lox控制。在去除终止元件后，内源性水平的致癌KRASG12D被表达。去除终止元件是通过Cre来实现，Cre是一种重组酶，来源于P1噬菌体，其基因编码区序列全长1029 bp, 为38 kDa大小的、由343个氨基酸组成的多肽单体蛋白。Cre能识别特异的DNA序列，即loxP位点，使两个loxP位点间发生基因重组。本实验利用气管插管递送载有Cre重组酶的腺病毒（adenoviruses expressing Cre，Ad-Cre）感染KRASLSL-G12D条件突变小鼠肺组织细胞，通过切除位于KRASG12D转基因上游的Lox-Stop-Lox, 进而使肺组织表达KRAS突变。

由于B6-KRASLSL-G12D纯合子胚胎期即发生死亡，因此使用的KRAS条件突变小鼠均为杂合子，在繁衍过程需要不断进行基因鉴定，出生后1～2周的小鼠收集少量脚趾或鼠尾组织，使用小鼠组织直接PCR试剂盒进行基因PCR鉴定，根据说明书配置PCR反应体系。反应条件：(1) 预变性94 ℃,5 min; (2) 35个循环反应：变性94 ℃,10 sec ;退火60 ℃,20 sec; 延伸72 ℃,30 sec; (3) 终延伸72 ℃,5 min。反应结束后各取4 μL,进行琼脂糖凝胶（1.5%）电泳（100 V, 30 min），电泳完毕进行核酸凝胶显像。

在1～8个月每个时间段均成功造模20只小鼠，其中雌鼠和雄鼠各10只。通过小鼠肺HE染色，统计肺腺癌成瘤情况。结果显示1个月的成瘤率为20%，2个月30%，3个月50%，4个月70%，5个月90%，6～8个月均为100%。通过各个感染时间的成瘤率绘制折线图，可以看出随着时间的延长，成瘤率越来越高，当时间达到6个月时，所有的小鼠均发生了肺腺癌。

通过构建肺腺癌模型，我们可以更好地模拟人类肺腺癌的发展过程，从而提高对肺腺癌病理学和分子生物学的理解。相较于化学诱导模型或移植瘤模型，基因编辑模型更贴近生物学真实情况，更准确地反映了肿瘤的自然发展过程。我们的模型允许控制肿瘤发生的时间，且成瘤周期与自发性肿瘤类似。可用于观察不同阶段的肺腺癌情况，为研究肿瘤的发生发展提供重要的研究工具。既往对小鼠肺腺癌原位移植瘤的研究显示，原位移植瘤的成瘤时间基本在1个月内。相对于原位移植瘤，基因编辑模型的成瘤时间相对较长，生存期也相对较长，这为药物研发提供了更长的观察期，为新药的研发提供了更为充分的时间窗口。

Source: 现代肿瘤医学.  2024, 32 (18)，KRAS条件突变小鼠肺腺癌模型的构建