乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，据估计，在较发达地区乳腺癌的发病率为74.1%，病死率为14.9%，是继肺癌之后的第二大常见恶性肿瘤和第五大致死疾病。尽管现在的医疗水平提高了乳腺癌的检出率及治疗效果，但是仍然有部分患者不能从中获益，其主要原因是乳腺癌发生了淋巴结转移或远端转移。淋巴结是机体重要的外周免疫器官，在免疫方面发挥着关键作用，当细菌或病毒入侵人体时，淋巴结能够抵抗及清除外来异物，减少机体出现感染性疾病的风险。然而，在肿瘤转移过程中，癌细胞能够进入淋巴管再通过淋巴液迁移到引流淋巴结中，并且在引流淋巴结中增殖，使引流淋巴结发生病变，甚至还能从引流淋巴结中逃逸扩散到其他器官。临床上，淋巴结的状态作为分期预后因素的诊断价值已被广泛重视，并且对淋巴结转移与否以及转移程度的评价将决定患者的后续治疗。因此在肿瘤发生淋巴结转移后，淋巴结在抗肿瘤免疫中发挥的作用以及在淋巴结转移后如何对患者进行精准治疗仍需进一步研究。

为了对乳腺癌淋巴结转移机制进行深入研究，目前急需建立稳定成熟的动物模型，重现临床上乳腺癌淋巴结转移的现象，以期后续开展肿瘤学相关基础研究解决临床上淋巴结转移这一实际难题。目前针对建立肿瘤淋巴结转移的动物模型主要有舌下接种法、脚掌接种法、睾丸内接种法、骨髓内接种法、背部接种法及耳部接种法等，基于其使用的实验动物的多样性及实验操作的复杂性和稳定性，期望通过总结并优化实验技术，对小鼠的不同部位进行荷瘤建立不同的乳腺癌淋巴结转移模型，并通过操作可行性、肿瘤生长速度、淋巴结病理检测及小鼠生存等综合评价不同建模方式的优劣性，从而筛选出最稳定可靠的动物模型，为乳腺癌淋巴结转移的研究奠定基础，进而为临床准确评估患者风险和预后提供参考。

建模方法：

PyMT小鼠自发淋巴结转移模型

MMTV-PyMT转基因小鼠模型是通过植入PyMT基因到乳腺特异性启动子腺病毒（MMTV）的表达载体中建立的。乳腺特异性启动子的作用使得PyMT基因在小鼠乳腺组织中高表达，从而使小鼠出现乳腺肿瘤的表型。利用该小鼠自发乳腺癌的特性来观察其淋巴结转移规律。通过对病理切片进行分析后发现该淋巴结形成了明显的巢状肿瘤，结构破坏明显，滤泡数量减少，髓窦形态明显改变，可以看到淋巴细胞与肿瘤细胞形成了明显的分界线。结果提示MMTV-PyMT小鼠发生了肿瘤细胞淋巴结转移，且淋巴结转移率为100%，成瘤率也为100%，MMTV-PyMT转基因小鼠模型具有自发性转移、可重复性和接近病理状态的特点，提示其是一个理想的乳腺癌淋巴结自发转移研究模型。

腹股沟淋巴结-对侧淋巴结型

将BALB/c小鼠后肢腹部和腿部备毛后，对小鼠进行麻醉处理，使用无菌剪刀和镊子在其腹股沟处剪开约1 cm的小口，取4T1细胞悬液5 μL，共计5×105个细胞，使用一次性无菌胰岛素注射针将细胞悬液接种于小鼠腹股沟处淋巴结中。在细胞悬液进入淋巴结后，可观察到淋巴结明显凸起，以此确定肿瘤细胞悬液在小鼠淋巴结内注射成功。通过对病理切片分析发现淋巴结内部组织已经坏死，并且形成较多空泡，淋巴结中存在大量的细胞核碎片；从细胞核形态上判读，应是肿瘤细胞来源，说明此时该模型已发生淋巴结转移，但由于取材时间太晚，肿瘤组织已经破坏，未能观察到界限清楚的肿瘤转移灶，此时的淋巴结已经随着肿瘤细胞的侵袭发展为淋巴瘤。在实验过程中发现该荷瘤模型的操作方法难度较大，荷瘤成功率仅为50%。因此，该模型的构建对操作者技术要求较高，重复性较低，易操作失误形成皮下瘤，不能成功建立模型。

腿部-腹股沟淋巴结模型

取4T1细胞悬液100 μL，含5×105个细胞，使用一次性无菌胰岛素注射针皮下接种于BALB/c小鼠左后肢大腿处。通过对病理切片分析发现淋巴结已经被肿瘤细胞侵袭形成了肿瘤亮区。内部细胞结构发生改变，转移的乳腺癌细胞大小、形态差异大，没有形成腺体样结构，但明显不同于正常的淋巴细胞。对病理切片进一步分析发现，随着肿瘤细胞的侵袭在淋巴结内形成了2个转移灶，如图3B中黑色实线圈画部分所示。同时通过对比前哨淋巴结（SLN）和对侧淋巴结（CLN）质量发现引流淋巴结的质量显著增加。说明小鼠后肢皮下荷瘤26 d后肿瘤细胞会发生远处转移，重塑淋巴结结构和细胞组成，最终形成淋巴结转移灶。同时该模型操作简单，成瘤率为100%，重复性好，但发生转移的时间较长，不利于后续实验的进行。

后脚掌-腘窝淋巴结模型

取4T1细胞悬液50 μL，含5×105个细胞，使用一次性无菌胰岛素注射针皮下接种于BALB/c小鼠左后肢脚掌。结果显示在腘窝处的淋巴结中出现了2处成片的肿瘤亮区，说明肿瘤细胞在淋巴结内形成了2处转移灶。该部位的细胞形态不规则，说明转移的乳腺癌细胞形态差异大，虽然没有形成腺体样结构，但细胞表面成泡状，与正常淋巴细胞的结构和形态完全不同。同时发现前哨淋巴结（SLN）质量较对侧淋巴结（CLN）质量显著增加。这也证明通过脚掌荷瘤建立向淋巴结转移的小鼠模型是可行的。

舌下-颈内静脉肩胛舌骨肌淋巴结模型

用镊子将麻醉后的BALB/c小鼠舌头固定，取4T1细胞悬液50 μL，含5×105个细胞，使用一次性无菌胰岛素注射针接种于BALB/c小鼠舌左缘黏膜下。根据病理切片的结果显示，小鼠淋巴结正常形态存在，无肿瘤细胞侵袭。同时荷瘤小鼠的前哨淋巴结（SLN）与正常小鼠淋巴结（Control）质量无明显变化。该荷瘤模型成瘤后易引起小鼠进食困难，从而导致小鼠消瘦，在荷瘤的第9天造成小鼠死亡，存活时间短不利于后续其他实验的进行。

骨髓内-腹股沟淋巴结模型

取 4T1细胞悬液8 μL，含5×105个细胞，使用一次性无菌胰岛素注射针接种于麻醉后的BALB/c小鼠后肢腿胫骨中。结果显示小鼠腹股沟淋巴结未发生变化，其结构完整，滤泡分布均匀。前哨淋巴结（SLN）与对侧淋巴结（CLN）质量无明显变化，说明此种方法在构建淋巴结转移小鼠模型上不易成功。该种方法的成瘤率为70%，较其他荷瘤方式成瘤率低。

右上背皮-腋窝淋巴结模型

取4T1细胞悬液100 μL，含5×105个细胞，使用一次性无菌胰岛素注射针皮下接种于BALB/c小鼠右上背皮下。结果显示小鼠腋窝处淋巴结结构形态完整，淋巴细胞未发生变化，同时前哨淋巴结（SLN）的质量与对侧淋巴结（CLN）相比未发生显著变化。此荷瘤方式简单，成瘤率可达100%，但肿瘤细胞向腋窝淋巴结的侵袭较缓慢，在荷瘤后17 d依然未见淋巴结结构、形态发生改变，细胞间质也未见明显变化。

乳腺癌是常见的恶性肿瘤之一，严重威胁女性的生命健康，2022年美国新增287 850例侵袭性乳腺癌，其中因乳腺癌而死亡的患者约43 250例。乳腺癌发生转移与否决定了患者的治疗方法及预后情况，但目前对于乳腺癌的转移机制尚未明确，而乳腺癌最常见的转移部位便是腋窝淋巴结。为深入了解乳腺癌淋巴结的转移机制，目前急需建立稳定、高效、易重复的乳腺癌淋巴结转移模型。

肿瘤转移模型主要包括自发性肿瘤转移模型、移植性肿瘤转移模型和诱发性肿瘤转移模型。其中诱发性转移模型的肿瘤发生转移率较低；移植性肿瘤转移模型虽然发生转移率高、方法简单，但是其对手术无菌操作要求严格且成瘤周期较长，更重要的是个体差异较大，不适用于所有的实验动物。因此，在本实验中主要选择了自发性肿瘤转移模型进行研究。在所采用的7种荷瘤模型中，PyMT小鼠自发淋巴结转移模型的淋巴结转移率为100%,可形成巢样乳腺组织结构，同时其自发成瘤导致淋巴结转移与临床患者的现象更加吻合，直接选用PyMT小鼠就能满足实验要求，无需其他实验操作，但选择该模型进行研究时耗费的成本远高于其他自发性肿瘤转移模型，同时该模型用于研究肿瘤淋巴结转移时肿瘤负荷较大，且可能形成多个肿瘤，不利于后续相关实验的进行。

Source: 陆军军医大学学报. 2024, 46 （16），乳腺癌淋巴结转移动物模型的建立及评价，DOI: 10.16016/j.2097-0927.202312031