常规电镜样品制备标准方法

常规电镜样品制备包括常温化学双固定、常温脱水包埋、常规超薄切片、普通电镜观察几个步骤。样品制备过程历时约一周，超薄切片经醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色后，电镜观察。所有操作均按照以下流程进行。

试剂材料
0.2 mol/ L磷酸盐缓冲液
Na2HPO4·2H2O 35.61 g 或Na2HPO4·7H2O 53.65 g / Na2HPO4·12H2O 71.64 g
NaH2PO2·H2O 27.60 g 或NaH2PO4·2H2O 31.21 g
加双蒸水（ddH2O）到1000 mL
0.1 mol/ L磷酸盐缓冲液（PBS）
0.2 mol/ L磷酸盐缓冲液 250 mL
加双蒸水到500 mL
2 % 低温琼脂
低温琼脂 1.0 g
加双蒸水到 50 mL
加热到沸腾，溶液均匀后备用
1 % 戊二醛固定液
25 %（m/v）戊二醛水溶液 2 mL
0.2 mol/ L磷酸盐缓冲液 25 mL
加双蒸水到50 mL
1 % 锇酸固定液
2 %（m/v）锇酸水溶液 10 mL
0.2 mol/ L磷酸盐缓冲液 10 mL
包埋剂A液
Epon 812 树脂 50 mL
十二烷基琥珀酸酐（modecenyl succinic anhydride, DDSA） 80 mL
包埋剂B液
Epon 812 树脂 50 mL
六甲酸酐（methyl nadic anhydride, MNA） 44.5 mL
2，4，6 - 三甲氨基甲基苯酚（2, 4, 6 - tridimethylamino methyl phenol, DMP-30）
甲苯胺蓝染液
甲苯胺蓝 1 g
1 mol/ L NaOH 10 mL
加双蒸水到50 mL
混匀过滤后使用
1 % 醋酸双氧铀染液
醋酸双氧铀 0.2 g
加双蒸水到10 mL
封口膜封口，4℃避光保存
1 % 柠檬酸铅染液
硝酸铅 0.265 g
柠檬酸钠（含2分子结晶水） 0.352 g
加双蒸水到10 mL①
① 配制铅染液时，要先加水6 mL，超声震荡30 min，使乳白色柠檬酸铅悬液充分混匀。然后滴加1 mol/L NaOH，并不是晃动，直至溶液变清亮。最后定容至10 mL。
② 细胞样品处理和藻类及其他游离样品处理流程可相互参照，即细胞样品可以酌情使用琼脂铸模法取材固定，藻类及其他游离样品也可以使用血清预包埋法取材固定，总体视样品密度及其对于温度的耐受等条件而定。
封口膜封口，4℃保存

仪器
修块机 Leica EM TRIM
切片机 Leica EM UC6
光学显微镜 Nikon 80i 及配套拍照系统DS-L1
透射电子显微镜 JEOL-1230
Gatan Bioscan Camera 792

实验流程
一、 取材与固定
A. 植物样品
1. 自来水冲洗表面泥尘后，使用灭菌水清洗2-3次，置于铺有预湿滤纸的培养皿中。
2. 使用干净锋利的刀片切取目标材料，所取材料体积不大于3 mm3。
切取样品时应注意动作迅速、减小损伤，避免来回切拉；使用的灭菌水及器具应4℃预冷，并在操作中尽量保持低温以降低组织细胞活性。
3. 将切下材料放入装有预冷的戊二醛固定液的青霉素小瓶中后抽气，抽几次后轻摇小瓶，并打开瓶盖。重复2-3次，直到样品沉入瓶底。
4. 室温静置1h，或摇床轻摇1h。
5. PBS清洗3次，10min/次。
6. 1%锇酸固定液固定1h。
7. PBS清洗3次，10min/次。

B. 动物样品
1. 4℃预冷生理盐水冲洗组织块，迅速切取组织块，体积不大于3 mm3
2. 将切取的组织块投入装有预冷戊二醛固定液的青霉素小瓶中，并抽气直至样品沉底。
3. 室温静置1h，或摇床轻摇1h。
4. PBS清洗3次，10 min/次。
5. 1%锇酸固定液固定1 h。
6. PBS清洗3次，10 min/次。

C. 单层培养细胞或悬浮培养细胞样品②
1. 3000 rpm离心5 min，收集细胞样品，尽量多的吸弃培养液上清。
2. 加入4℃预冷PBS液，充分吹吸混匀，静置4 min，3000 rpm离心5 min，吸弃上清。
① 配制铅染液时，要先加水6 mL，超声震荡30 min，使乳白色柠檬酸铅悬液充分混匀。然后滴加1 mol/L NaOH，并不是晃动，直至溶液变清亮。最后定容至10 mL。
② 细胞样品处理和藻类及其他游离样品处理流程可相互参照，即细胞样品可以酌情使用琼脂铸模法取材固定，藻类及其他游离样品也可以使用血清预包埋法取材固定，总体视样品密度及其对于温度的耐受等条件而定。
3. 重复步骤2一次。
4. 加入预冷的血清或蛋清，充分吹吸混匀，3000 rpm离心10 min，吸弃大部分上清，留少部分，吹吸悬浮沉淀细胞。（或离心后吸弃上清，留少部分上清，不悬浮沉淀细胞，视样品浓度而定）
5. 缓慢加入戊二醛固定液，小心放入4℃冰箱，固定过夜。
6. 吸弃上清，刀片小心划开离心管壁，用钳子拉开离心管，小心取出已凝成固体的血清包埋块。
7. 使用干净的单面刀片或手术刀，将血清包埋块切成2 mm3左右的小块，取3-5个富集细胞样品效果较好的包埋小块继续下面实验。
8. PBS清洗3次，10 min/次。
9. 1%锇酸固定液固定1 h。
10. PBS清洗3次，10 min/次。

D. 藻类及其他游离培养样品
1. 吸取2%低温琼脂液200μL到0.2mL离心管，并将离线管置于冰上，取10μL枪头迅速插入琼脂中并保持离心管竖直，且枪头竖直靠中的包裹在琼脂中。
2. 静置1 min，待琼脂凝固后，小心拔出枪头，形成琼脂空腔，待用。
3. 3000 rpm离心5 min，收集样品，尽量多的吸弃培养液上清。
4. 加入4℃预冷PBS液，充分吹吸混匀，静置4min，3000 rpm离心5min，吸弃上清。
5. 重复步骤2清洗，吸弃大部分上清，留极少部分上清液，吹吸悬浮样品。
6. 使用10μL 移液器小心将样品加入已经制备好的琼脂空腔中，使样品充满空腔大部分，添加过程中尽量避免气泡出现。
7. 吸取50μL溶化的琼脂，快速滴加到空腔琼脂上封口，冰浴5 min，待琼脂完全凝固。
8. 使用单面刀片小心划开离心管壁，用钳子拉开离心管，小心取出已凝成固体的琼脂包埋块，稍作修葺。
9. PBS清洗3次，10 min/次。
10. 1%锇酸固定液固定1 h。
11. PBS清洗3次，10 min/次。

二、 脱水
1. 按丙酮与灭菌水体积比3：7配制30%脱水剂。吸弃样品管/瓶中的PBS，快速加入现配的脱水剂（脱水换液过程禁止出现样品暴露空气中现象，可不全部吸完，略有剩余，使样品浸润；动作应迅速准确），室温放置或摇床轻摇45 min。加入按30%、50%、70%、90%、100%（v/v）的浓度梯度进行脱水。
2. 配制50%脱水剂，快速换液，室温轻摇45 min。
3. 配制70%脱水剂，快速换液，室温轻摇45 min。
4. 配制90%脱水剂，快速换液，室温轻摇45 min。
5. 使用纯丙酮快速换液，室温轻摇30 min③。
6. 重复步骤5一次。

三、 渗透包埋
在此步脱水操作完成后即可开始配制渗透用包埋剂，以免安排不周。样品浸泡在纯丙酮中时间不宜过久，以免造成样品较脆，不利于超薄切片。

1. 配制渗透用树脂包埋剂
1) 取干净的10 mL注射器，拔去活塞，用封闭针头堵住注射口，放于通风橱中。
2) 小心倾倒B液9 mL到注射器中；然后再小心倾倒A液1 mL。
3) 插入活塞，堵住注射器后，颠倒摇匀至液体颜色均匀，无丝状液体。
4) 小心拔去活塞，通风橱中操作，缓慢滴加14滴DMP-30。
5) 插入活塞，堵住注射器后，颠倒摇匀至液体颜色完全均匀，无丝絮状分色，竖直放置待用。
2. 按照包埋剂与丙酮体积比3：7配制30%渗透剂，快速吸弃样品管中纯丙酮并加入渗透剂，轻摇渗透3 h。
3. 按照包埋剂与丙酮体积比7：3配制70%渗透剂，快速换液，轻摇渗透过夜。
4. 重新配制包埋剂，并小心推按注射器，将包埋剂挤到包埋模具中至液面略凸。
5. 解剖针挑取样品到纯包埋剂中，渗透3 h。
6. 小心挑取样品，滤纸上稍微沾下吸弃部分粘附的包埋剂，轻轻放置到未渗透过样品的包埋孔中，小心将样品按到底，摆放好位置。记录各样品对应包埋块编号。
7. 梯度温度聚合包埋
1) 37℃烘箱中12 h，期间定时观察样品有无漂移现象，如有，则再次小心摆放样品位置。
2) 45℃烘箱中12 h。
3) 60℃烘箱中24 h。

四、 修块与切片
1. 拿到包埋块后检查样品位置是否得当，选取位置好的包埋块优先进行修块、切片。
2. 粗修包埋块
1) 使用六角扳手将包埋块固定在样品头上，露出长度合适。
2) 将样品头固定在修块机上，体视镜观察修块，分四个方向将包埋块头部多余的包埋剂修去，暴露出组织块。
3) 使用锋利的单面刀片修去组织块周围毛刺的包埋剂，使其四边光滑清晰。
4) 卸下样品头装至切片机上，使用玻璃刀修片，直至样品表面光滑清晰。
3. 半薄切片
1) 将粘有水槽的玻璃刀装至切片机刀台上，体视镜下小心对刀，不时转动手轮，使样品上下移动，调整刀台左右角度及样品上下角度，直至包埋块整个表面与刀刃的距离相等。
2) 转动手轮，使整个样品高于刀刃，点控制面板Start，设置切片区域上边界；转动手轮，使整个样品低于刀刃，点控制面板End，设置切片区域下边界。
3) 手动步进刀台靠近样品，至出现彩色干涉光，继续步进刀台，并通过体视镜观察干涉光谱变化，直至干涉光消失。
4) 转动手轮，使样品离开刀刃区域，使用滴管将干净的去离子水加到玻璃刀水槽中，体视镜观察直至液面略低于刀刃。
5) 调整切片厚度与速度，按控制面板Run/Stop键，开始切片。体视镜观察可见900nm厚度切片反光为亮绿色。
6) 待有切片下来形成4-6片的切片带，按Run/Stop键停止切片，体视镜观察下，使用睫毛笔将所需薄片拨离刀刃，并将所需切片聚拢一起。
7) 用干净捞片环轻轻沾取切片所在区域，根据水膜表面张力捞取切片，放到干净载玻片上，酒精灯略微加热，使水蒸干，并对着光亮用记号笔标示切片所在位置。
4. 半薄切片染色
1) 吸取20μL甲苯胺蓝染液，滴加到载玻片放有切片的位置，室温静置30 s 。
2) 去离子水冲洗玻片，直至不再有蓝色。吸水纸上沥干，酒精灯略微加热，加速切片上的水分蒸发。
3) 显微镜观察切片质量和样品位置。
5. 精修包埋块
1) 移去装有水槽的玻璃刀，取下装有包埋块的样品头，装至修块机上。
2) 根据半薄切片结果，使用新的锋利刀口，小心修理包埋块四边，使其尽可能的光滑、平整。
6. 超薄切片
1) 将钻石刀装至切片机刀台上，体视镜下小心对刀，不时转动手轮，使样品上下移动，调整刀台左右角度及样品上下角度，直至包埋块整个表面与刀刃的距离相等。
2) 转动手轮，使整个样品高于刀刃，点控制面板Start，设置切片区域上边界；转动手轮，使整个样品低于刀刃，点控制面板End，设置切片区域下边界。
3) 手动步进刀台靠近样品，至出现彩色干涉光，转动手轮，使样品上下移动，调整刀台左右角度及样品上下角度，直至包埋块整个表面与刀刃的干涉光谱颜色一致；继续步进刀台，并通过体视镜观察干涉光谱变化，直至干涉光消失。
4) 转动手轮，使样品离开刀刃区域，使用滴管将干净的去离子水加到玻璃刀水槽中，体视镜观察直至液面略低于刀刃。
5) 调整切片厚度与速度，按控制面板Run/Stop键，开始切片。体视镜观察可见70nm厚度切片反光为亮灰色及浅灰色。
6) 待有切片下来形成10-20片的切片带，按Run/Stop键停止切片，体视镜观察下，使用睫毛笔将所需薄片拨离刀刃，并将所需切片聚拢一起。
7) 用干净捞片环轻轻沾取切片所在区域，根据水膜表面张力捞取切片，轻轻放到干净载膜铜网上，用尖角滤纸靠近铜网边缘缓慢吸干水分。
8) 轻轻移去捞片环，将载有切片的铜网放到铺有滤纸的平皿中，晾干待染色观察。

五、 染色
1. 醋酸双氧铀染色
1) 按每片载网20μL染液的量吸取醋酸双氧铀染液，13 200 rpm离心5 min。
2) 将放有切片的载网小心放到染色盘上，有切片面靠上，并稍微用镊子按载网边缘，使其与染色盘接触粘附牢固。
3) 吸取20μL染液滴加到载网上面，盖上平皿防尘，室温染色30 min。
4) 将染色盘整个放到装有去离子水的清洗缸中，轻摇清洗1 min。
5) 小心取出染色盘，更换水洗液，轻摇清洗5min。
6) 重复清洗2次。
2. 柠檬酸铅染色
1) 按每片载网20μL染液的量吸取醋酸双氧铀染液，13 200 rpm离心5 min。④
2) 在放置染色盘的平皿中放入2片固体NaOH，用以吸收平皿中CO2气体。
3) 吸取20μL染液滴加到载网上面，盖上平皿防尘，室温染色8 min。
4) 将染色盘整个放到装有去离子水的清洗缸中，轻摇清洗1 min。
5) 小心取出染色盘，更换水洗液，轻摇清洗5min。
连续染色时，载网不需要从染色盘上拿下，清洗后直接进行铅染即可，但是铅染液要现用现取。
6) 重复清洗2次。
7) 小心夹取载网，放置到铺有滤纸的干净平皿中，晾干待电镜观察。

六、 电镜观察
1. 取出样品杆，打开样品夹，小心放入载网，合上样品夹，并转动样品杆，轻敲确保样品夹已准确固定载网。
2. 将样品杆插入透射电镜样品室，开始抽气。
3. 打开灯丝开关，等待检测电流出现后，打开观察窗开始观察。
4. 先在低倍下找到切片，再高倍观察切片，寻找待看目标，仔细对焦。
5. 将切片目标区域遇到观察窗中间后，调整灯丝电流密度为3.8 pA/cm2。
6. 插入拍照CCD，Start View，微调焦距，Start Acquire 拍照。
7. 拍照完毕，按格式需求保存照片到指定文件夹。
8. 使用专用写保护闪存盘拷贝数据到公共电脑观察、使用。