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SNP研究全攻略——从临床到动物模型

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生活中你是否会有种疑惑:为什么有的人喝了牛奶长得又高又壮,有的人喝了牛奶就拉稀?为什么有的人吸烟身体变差,有的人却非常长寿?为什么有的人吃药病好了,有的人吃药却不管用?面对这些困扰无数人的差异,大家是否感觉受到了命运的捉弄。今天,小编就来聊一聊造成某些人“天赋异禀”的关键:SNP。注意,小编说的SNP可不是韩国面膜,而是Single Nucleotide Polymorphisms,即单核苷酸多态性。

SNP这一概念首次出现于1994年发表的人类分子遗传杂志上,随后于1996年由美国麻省理工的Lander正式提出。SNP研究被认为是联系基因型和表现型之间关系的桥梁,是研究人类基因组计划走向应用的重要步骤[1,2]。

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图1 美国学者Eric S. Lander于1996年正式提出SNP为第三代分子标记

SNP的定义

SNP主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性, 即在群体中,基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的核苷酸,并且其出现的频率大于1%。

这里,还需注意另外两个概念,点突变(point mutation)及单核苷酸变异(SNV, single nucleotide variant)。如果单个核苷酸的变异在群体中出现频率低于1%,则看作点突变;如果只是在病人体内检测到单个核苷酸的变异,而其在人群中出现的频率未知,则可看作SNV。

从理论上来看,每一个SNP 位点都可以有4 种不同的变异形式(C、G、T、A)但实际上发生的只有两种,即转换(transition)(C变换为T,在其互补链上则为G变换为A)或颠换(transversion)(C变换为 A,G变换为 T,C变换为 G,A变换为 T)(图2)。因此通常所说的SNP都是二等位多态性的。也就是说,大多数情况下,C都是变成T,而变成A和G的概率很小,所以一般认为SNP是二等位的,或者是二态性。

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图2 基因组上的SNP位点

SNP与人类健康

SNP 在人类基因组中的发生频率比较高,大约平均每1000个碱基对中就有一个多态位点,估计其总数可达300万个甚至更多[2]。当SNP发生在基因编码区或基因的调节区域时,它会对基因表达产生巨大的影响,从而影响基因的功能。有一些SNP位点已被证明在人类健康研究中非常重要,例如镰状细胞贫血、β地中海贫血和囊性纤维化的发生主要是由于SNP的出现。同时,研究人员发现,SNP可能有助于预测个体对某些药物的反应、对毒素等环境因素的易感性以及罹患特定疾病的风险。例如,携带有APOE(载脂蛋白)ε4突变的个体表现出患阿尔茨海默病的更高风险[3,4](图3)。

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图3 APOE4促进病理性tau蛋白的再分配。

a:人源APOE敲入小鼠海马体tau蛋白染色结果;b:Tau蛋白阳性区域占海马体齿状回部位的面积 (TE2:APOE2敲入小鼠, TE3: APOE3敲入小鼠, TE4: APOE4敲入小鼠, TEKO: ApoE敲除小鼠)[4]

全基因组范围内SNP关联分析

随着测序技术的发展,全基因组关联分析(Genome-wide Association Study,GWAS)已广泛应用于复杂疾病的遗传因素分析(图4),可以更高效地获得疾病与SNP之间的相关性。GWAS利用高通量测序技术,分析数以万计的SNPs以及这些SNPs与临床表型和可测性状的相关性,从而全面地揭示出不同复杂性状的遗传机制。目前,全世界范围内已开展了4000多项GWAS研究,发现了超过10万个与各种疾病(如癌症,高血压,II型糖尿病,类风湿性关节炎等)以及重要生理性状关联的基因位点。

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图4 GWAS分析人群中等位基因的变异频率(https://www.ebi.ac.uk/)

完成了GWAS分析之后,我们还需要借助下游工具对GWAS的分析结果进一步注释和挖掘,筛选可能致病的SNP位点。相关的注释网站和数据库很多,以下推荐2个网站,供大家参考。GWAS4D是通过组织/细胞类型特异性和非编码调控变异的优先排序,来预测特定复杂疾病和性状的潜在致病机制。我们将GWAS summary数据导入,便可以输出SNP位点的优先排序、SNP位点在基因组区域的可视化以及SNP功能预测和注释等结果(图7)。网址:http://mulinlab.tmu.edu.cn/gwas4d 。

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图5 GWAS4D可进行分析的界面

SNPedia是一个SNP百科全书类网站,它引用已经发布的文章或者数据库信息,对SNP位点进行描述,共享着人类基因组变异的信息。我们可以搜索某个SNP位点来寻找与之相关的信息,也可以根据相关疾病和症状来寻找相关的SNP(图6)。网址:https://www.snpedia.com/index.php/SNPedia。

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图6 SNPedia首页

类人SNP点突变小鼠的构建

受益于二代测序及GWAS的联合应用,研究人员发现了众多和临床表型具有一定联系的SNP位点,然而要验证这些位点与临床表现的关系,必须回到体内进行研究。如果这些突变可以在小鼠体内找到,那么突变小鼠就能为临床研究提供宝贵的信息。因此构建突变小鼠,是有效验证临床检测结果的关键一步。

构建突变小鼠时,首先需要确定的是突变位点的人鼠同源性及保守性。小鼠是解析人类基因功能、研究人类疾病重要的模式生物。99%的人类基因都可以在其基因组中能找到相应的基因。但需要注意的是,人鼠编码基因序列相似性平均为85%,而非编码基因的相似度只有50%[5],因此找到同源基因还需要判断突变位点的序列保守性。

这里举一个例子,PLD3的一个SNP(rs145999145)是迟发性阿尔兹海默症的危险因素之一。我们在NCBI-SNP数据库可搜索到该SNP的位点信息,如下:

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图7 rs145999145在NCBI数据库中的信息页

可见红色框中提供了突变位点的序列信息,而绿色框中提示了突变类型是错义突变(图7)。根据该位点附近的侧翼序列以及给到的基因组位点,我们可以找到其在人源PLD3基因上的位置,转录本NM_012268.4,c.694 G>A,也即p.232V>M,位于exon9。通过对人鼠同源基因的同源性分析(图8),可以很快找到相应小鼠的突变位点:NM_001317355.1,c.688 G>A,p.230V>M,位于exon10。

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图8 人鼠PLD3蛋白同源性对比结果

确定了小鼠的突变位点后,我们便可以针对该突变位点设计Guide RNA,利用Crispr/Cas9技术来构建点突变小鼠(图9)。

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图9 PLD3-V230M突变小鼠构建策略

案例分享

接下来和大家分享一个案例来具体说明如何利用基因修饰小鼠验证SNP的临床表型。

【标题】自身免疫疾病相关IgG1变体调控B淋巴细胞活化和分化的新机制

【期刊】Science (IF=41)

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系统性红斑狼疮SLE是最常见的自身免疫疾病之一,是一种由遗传、环境、免疫等多种因素导致的复杂性疾病。其发病机制至今尚不清楚,导致治疗手段有限且无法根治。人体中广泛存在具有自身反应性的IgG型记忆性B细胞,SLE等自身免疫疾病常伴随大量自身抗体的产生。

研究人员猜想IgG型B细胞受体(IgG-BCR)的异常活化可能参与到SLE的发病过程。通过对患者进行基因检测,研究人员发现,IgG1重链基因IGHG1上的SNP(rs117518546)在SLE患者中显著增加,该SNP导致IgG1第396位甘氨酸突变为精氨酸(IgG1-G396R)(图9)。携带该SNP的SLE患者产生更多更广泛的IgG1型的自身抗体,发生炎症反应的风险增加,疾病活动指数也更高,揭示该SNP为新的SLE易感基因位点。

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图10 rs117518546突变位点(图A)及在不同地区人群中的比例(图B)

值得注意的是,该SNP在东亚人群中的出现的频率远高于欧美人群(图10),这提示该SNP是以汉族为代表的东亚人群特有的SLE易感基因位点,可能是我国SLE患者与其他人群患者的临床表现和治疗反应存在差异的因素之一。

通过同源性对比,研究者发现该SNP在小鼠上的位点为390位甘氨酸突变为精氨酸,因此构建了IgG1-G390R突变小鼠(图11)。通过诱导野生型小鼠和突变小鼠发生自身免疫疾病,研究者发现携带该SNP的小鼠产生更多、更广泛的自身抗体,而这依赖于B细胞受抗原刺激后大量自身反应性浆细胞的分化(图12)。这一结果验证了在SLE患者中的发现,并从B细胞命运决定层面给出了初步解释[6]。

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图11 构建IgG1-G390R敲入小鼠

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图12诱导自身免疫病发生后,野生型小鼠和G390R小鼠体内dsDNA和SmD抗体动态变化。

该研究从疾病易感基因位点的临床遗传学研究出发,经过基于基因修饰小鼠的动物模型研究,将临床上发现的问题在真实的体内实验中验证,确认了IgG1-G396R在SLE疾病发生发展中的作用。这项研究为SLE研究提供了全新的研究靶点,也为复杂疾病相关易感基因位点的研究提供了创新性的研究模式,最终发表在《Science》杂志上。

南模生物深耕基因修饰动物模型行业二十余年,在构建类人SNP同源突变小鼠方面具有丰富的经验,助力客户发表在《Cell Research》、《Immunity》等多种高水平杂志上,受到广泛认可。欢迎大家咨询,快来定制专属您的点突变小鼠吧。

参考文献:

[1]杨焕明. 人类基因组计划及其意义——规模化、序列化、信息化与产业化、医学化、人文化[J]. 科技与法律, 2000(3):2.

[2] Altshuler D, Pollara VJ, Cowles CR. An SNP map of the human genome generated by reduced representation shotgun sequencing. Nature. 2000 Sep 28;407(6803):513-6.

[3] https://www.snpedia.com/index.php/APOE-%CE%B54

[4] Shi Y, Yamada K, Liddelow SA, et al. ApoE4 markedly exacerbates tau-mediated neurodegeneration in a mouse model of tauopathy. Nature. 2017 Sep 28;549(7673):523-527. doi: 10.1038/nature24016

[5] https://www.nih.gov/news-events/news-releases/new-comprehensive-view-mouse-genome-finds-many-similarities-striking-differences-human-genome

[6] Chen X, Sun X, Yang W, et al. An autoimmune disease variant of IgG1 modulates B cell activation and differentiation. Science. 2018 Nov 9;362(6415):700-705. doi: 10.1126/science.aap9310. 

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