摘要：在过去十年中，斑马鱼开始作为发育生物学的典范，也得到了免疫学家和肿瘤学家的关注。斑马鱼具有体积小、繁殖力强、基因组完整等特点，是一个极具吸引力的模型体系。事实上，鱼在生命早期是透明的，结合越来越多的鱼免疫细胞报告，可以在体内追踪完整机体的免疫反应。由于斑马鱼从受精卵开始发育，可以从生命的开始监控免疫发育。斑马鱼是研究肠道炎症和损伤基本过程的一种有趣的模式生物。本文将首先提供斑马鱼肠道发育、细菌定植和免疫的一些背景知识，显示出与哺乳动物的相似性和差异性。

关键词：斑马鱼 小肠结肠炎 免疫 肠道 炎症

简介：事实上，鱼在生命早期（2周）是透明的，与免疫细胞报告鱼的生长表相结合，可以在体内对完整机体的免疫反应进行跟踪。由于斑马鱼从受精卵发育，从生命开始就可以监控免疫发育。在斑马鱼中，首先出现先天性免疫系统（巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞），其次是适应性免疫，从受精后的两到三周开始发展。斑马鱼通常在受精后2天从绒毛膜孵化，尽管这取决于温度。在较低温度下生长鱼类会延迟孵化。第3天斑马鱼开口，整个胃肠管在受精后第6天开放。此时，卵黄囊被消耗，幼虫开始进食小原生动物，如草履虫。在几个星期的过程中，肠道发展，同时几个细菌物种殖民胃肠道。

斑马鱼胃肠道：硬骨鱼类是极其多样化和丰富的鱼类群。当讨论鱼的胃肠道时，需要提到的一个重要特征是胃的存在。在硬骨鱼类中，我们可以找到有和没有胃的鱼。例如，尼罗罗非鱼和大西洋鳕鱼有胃，而河豚、百里香、鲤鱼和斑马鱼缺乏胃。胃腺首先出现在大约4亿5000万年前，似乎是大多数颚口（颚）脊椎动物的特征。由于H+/K+ - ATPase（ATP4A和ATP4B）和编码胃蛋白酶原的基因丢失，脊椎动物的胃腺丧失（脊椎动物肠的简化）发生了数次；斑马鱼不是胃，而是有前肠，称为肠球，它比后部有更大的内腔，因此可以作为与胃相媲美的储层。然而，根据Nalband等人的研究，这种肠球缺乏胃腺，因此没有低pH值。在稳态条件下，斑马鱼肠道的pH值不低于7.5。斑马鱼的肠管形成始于体节中期至后期（18体节），而在哺乳动物中，肠道在早期体节开始形成（1～2体节）。在18体节阶段，一个连续的内层薄层变得可区分，这将产生原始的肠内胚层。尽管斑马鱼肠道形成较晚，肠管形成的时间顺序是相同的。与哺乳动物一样，斑马鱼的喙肠首先形成，其次是后肠和中肠。肠道斑马鱼上皮层缺乏肠隐窝，然而，指状突起称为皱襞（绒毛），前部至后部的大小减小。发现不同分化的上皮细胞如吸收肠细胞（前肠和小肠）、黏液产生杯状细胞（整个肠）和肠内分泌细胞（前肠）。也没有发现经典的微体细胞（M）细胞，虽然第四上皮细胞类型被确定在肠的后段，其中含有大量空泡，其中可以存储腔内容物。Payle的缺失和卵泡相关上皮的缺乏提示斑马鱼没有M细胞，然而，上述M型空泡化细胞可能将管腔内容传递给存在于上皮层之下的分散免疫细胞。与哺乳动物相反，斑马鱼没有粘膜下层。哺乳动物的粘膜下层是一层疏松的结缔组织，包含血液和淋巴管和神经，位于粘膜下面（绒毛），将粘膜与下方的平滑肌层连接起来。在斑马鱼中，平滑肌层不那么复杂，直接附着在粘膜上。斑马鱼的肠神经细胞体存在于圆形和纵向平滑肌层之间。像哺乳动物一样，上皮细胞从褶皱的底部迁移到细胞凋亡的褶皱顶端。BrdU染色显示，这种迁移在前肠5～7天，中肠7～10天。与哺乳动物一样，上皮翻转和分化依赖于微生物定植。有趣的是，在斑马鱼中控制上皮细胞向分泌谱系分化的机制似乎是高度保守的，在哺乳动物中类似于Delta Notch信号。在没有缺口激活的情况下，所有上皮细胞分化为分泌谱系的细胞。同样，斑马鱼T细胞因子4（TCF4）在维持整个肠道的增殖性自我更新中是重要的。鉴于这种高功能同源性，斑马鱼是研究肠上皮更新机制的一个很好的模型。斑马鱼虽然没有像哺乳动物那样的5个肠段（即空肠、十二指肠、回肠、盲肠（阑尾）和结肠），但它们具有功能同源性。在斑马鱼中，三个不同的肠段在形态学和基因表达的基础上被区分：前肠段（肠泡）、中肠和后肠段。消化酶强烈表达于最长的皱褶的前段。这些消化酶和溶质转运蛋白存在在肠的前部和中部突出了这两个片段中营养吸收的功能。肠脂肪酸结合蛋白2在前肠和肠中部的表达最高，IFABP6主要表达于后肠。中肠的最后部分含有上述空泡状（M型）细胞，这可能表明除了营养吸收外，该区域可能在粘膜免疫中起作用。后部的上皮皱襞较短，这部分不含吸收的肠细胞，但很可能与水吸收有关。对成年斑马鱼的肠道进行微阵列分析，将其分成7个等长的段（从前1段到后7段）。

肠道微生物定植：地球上所有的动物，无论是水生动物还是陆地动物，都与环境中的微生物共同进化。从微生物生态学的研究进展来看，微生物不仅寄生在宿主体内，而且对宿主的生理和免疫也有很大的影响。反之亦然，宿主能够控制哪些物种能够在肠道内定居，通过对某些进行免疫应答而耐受其他物种。在益生菌动物中进行的研究表明微生物对宿主有巨大的影响。微生物可以影响食品加工，使其他不消化的食物成分可供宿主使用。同样，微生物可以合成维生素并刺激上皮更新。在这212个基因中，59个反应在小鼠和斑马鱼之间是保守的。这些保守的基因主要参与上皮细胞增殖、促进营养代谢和先天免疫应答。这表明对微生物的反应部分是高度保守的。微生物通过处理不可触及的食物成分来提高食物的能量吸收。在斑马鱼中，微生物的存在也会导致脂肪组织中脂肪的增加。微生物抑制血管生成素样蛋白4（ANGPTL4/FIAF）的肠上皮表达。ANGPTL4/FIAF是脂蛋白脂肪酶的循环抑制剂，通过抑制抑制剂的定植导致脂肪的储存。饮食诱导的微生物群组成的改变，如小鼠和人类，影响脂肪吸收和宿主能量平衡。微生物也诱导斑马鱼肠道发育。贝茨和同事发现，在没有微生物群的情况下，斑马鱼肠上皮在分化过程中停止。他们观察到缺乏刷状肠碱性磷酸酶活性，表面上不成熟的糖蛋白表达模式和杯状细胞和肠内分泌细胞的缺乏。此外，在没有微生物的情况下，斑马鱼肠不能在小肠中摄取蛋白质大分子。显示肠内容物的转运时间减少（更快的肠蠕动）。用细菌定植这些鱼逆转了效果。有趣的是，无细菌斑马鱼暴露于细菌脂多糖（LPS）或热灭活细菌可以重建碱性磷酸酶活性，但不影响对聚糖的表达，表明存在不同的宿主微生物反应途径。据报道，斑马鱼肠道中的上皮细胞增殖通过驻留微生物群的存在和Wnt信号转导的激活来刺激。他们表明，稳态先天免疫反应，但不是炎症信号有助于上皮增生的影响，因为微生物对上皮细胞的周转需要MYD88，而不是TNF受体。这也与小鼠发现一样，细菌刺激诱导斑马鱼细胞中NF-κB（免疫基因表达的关键调节因子）。无菌性斑马鱼激活NF-κB的细菌定植及其在肠和肠外组织中的靶基因表达。在肠道菌群建立过程中，诱导刷毛酶碱性磷酸酶的表达。除了其在消化中的作用，表明缺乏碱性磷酸酶的斑马鱼对LPS毒性敏感，并且显示肠中性粒细胞水平升高。这些发现说明微生物在斑马鱼肠道中形成中性粒细胞的稳态水平。对小鼠碱性磷酸酶活性的进一步研究表明，它也具有先前未知的免疫功能。

适应性免疫：在早期，斑马鱼完全依赖于它们固有的免疫系统，这使得在没有适应性免疫的情况下研究先天免疫过程。以前认为适应性免疫系统直到4周后才成熟。因为胸腺和头肾（初级免疫器官）在早期幼虫阶段仍然是基本的。斑马鱼胸腺仅从4 WPF开始获得更复杂的形状，髓质中的TCRα恒定区阳性细胞在2～3 WPF中可见。在2 WPF时检测到头肾RAG-1的表达。原位杂交法报告9日龄斑马鱼食管和肠中的部分TCR阳性细胞。总之，对于达到B和T细胞室功能成熟的年龄的证据仍然是有限的。LAM和同事们发现，在4 WPF之前，不能观察到T细胞非依赖性和T细胞依赖性的免疫应答（IgM）。表明斑马鱼免疫系统中的IgM反应在形态和功能上成熟于4～6 WPF。然而，这些研究是在鉴定IGZ之前进行的。IGZ-2转录物已经检测到2 WPF，这可能表明这种反应的快速发展。根据这些数据，目前比较安全的说法是，在生命的前两周，斑马鱼仅仅依靠先天免疫机制来防御。

先天免疫：抗菌肽（AMPS），由肠上皮细胞产生，在幼虫斑马鱼肠道形成第一道防线。AMPS是一种有效的广谱抗菌药物。AMPS是能杀死革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌、包膜病毒、真菌甚至转化或癌细胞的有效的广谱抗菌剂。在斑马鱼中，与其他鱼类一样，一些基因被复制和多样化，这可能导致这些细胞因子亚型的不同功能。有趣的是，与小鼠相反，斑马鱼具有CXCL8（IL-8），其与人CXCL8的功能相似。CXCL8是一种能吸引中性粒细胞的有效趋化因子。斑马鱼CXCL8在白细胞和肠上皮细胞中表达。已经证明，CXCL8L1（CXCL8A）在肠中的表达随时间动态变化。检测到在1 WPF和成人年龄（14 WPF）的低表达水平，但在5 WPF中在分散的粒细胞和上皮细胞中的表达增加。在5 WPF的RAG1缺陷斑马鱼中，CXCL8A的表达增加，而原位杂交只显示一些分散的细胞的染色，而它们的上皮细胞是阴性的。原始巨噬细胞也出现在血液循环开始之前。这些原始巨噬细胞迁移到大脑形成小胶质细胞，但能够吞噬并杀死被注射的细菌。标记巨噬细胞的MPEG1转基因斑马鱼特异性地显示巨噬细胞存在，尽管在整个胚胎包括小肠的28 HPF中的数量较低，并且随时间增加。最近，通过使用巨噬细胞表达肿瘤坏死因子α（TNFA）的转基因株系，Nguyen Chi和同事报告了巨噬细胞亚群的存在。

肠道炎症：为了充分利用斑马鱼的优势，有几个群体使用斑马鱼幼虫和成虫开发了肠道炎症模型。随着不同的先天免疫细胞的转基因报告鱼的发展，首次在健康和肠道炎症期间可以监测细胞募集。甚至在大多数转基因斑马鱼可用之前，Fleming和他的同事就用实验小鼠模型中的半抗原2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）开创了斑马鱼肠道炎症的领域。从3到8 dPF，将鱼浸泡在75μg/mL的TNBS中，观察到扩张的肠腔，肠皱襞（绒毛）消失，杯状细胞数量增加和5 DPF的上皮细胞出现上皮坏死因子α（TNF-α）阳性染色。强的松和5-氨基水杨酸是IBD患者的两种药物，改善了斑马鱼幼虫中TNBS诱导的疾病。这证实了与人类疾病状态相关的肠道生理学和病理学可以在斑马鱼幼虫中进行建模。浸泡在TNBS溶液中（50μg/ml 3天）的幼虫表现出明显的促炎标记物MMP9和白细胞增多。由于幼虫浸泡不仅会对肠道造成损害，而且会对皮肤造成损害，因此他们优化了方案，仅诱导肠道损伤而无皮肤损伤。幼虫暴露于75μg/ml TNBS三天，表现出广泛的皮肤损伤。暴露于低剂量TNBS或75μg/ml剂量的幼虫在三天内未出现皮肤损伤。在TNBS暴露的幼虫中观察到增殖细胞数量的显著增加。，与小鼠和人类一样，小肠结肠炎依赖于微生物群和Toll样受体信号，因为敲除MyD88导致TNBS暴露的死亡率增加。在后续研究中，奥赫勒和他的同事们用DSS开发了另一种小肠结肠炎模型，并将小肠结肠炎与TNBS诱导的小肠结肠炎进行了比较。DSS模型，如TNBS模型显示嗜中性粒细胞炎症，依赖于微生物。然而，DSS模型也显示出与TNBS诱导模型的显著差异：DSS诱导的结肠炎显示细菌过度生长，因为从整个幼虫匀浆中的细菌计数比未处理或TNBS处理的幼虫在暴露3天之后显示出更高的计数。暴露于TNBS后3天暴露的一氧化氮（NO）的增加在幼虫暴露于DSS时是不可见的。

结论：斑马鱼模型不仅可以用于研究人类疾病的潜在途径，它还可以作为研究水产养殖鱼类如大西洋鲑鱼食物诱发肠道炎症的一个重要模型。