摘要：斑马鱼已经在发育生物学和药物遗传学中成为流行的模式生物。结合强大的遗传和转基因工具，透明的胚胎和快速的幼体发育，斑马鱼的研究允许对许多动态过程进行详细的细胞分析。近几十年来，利用斑马鱼模型对性腺发育过程中的细胞和分子机制进行了深入的研究。我们简要概述了这些研究，并重点介绍了斑马鱼性别确定和性腺发育中涉及的必需基因。

关键词：性腺发育  斑马鱼 基因

简介：在动物中，存在两种不同的性别，这对于有性繁殖和物种的生存至关重要。 然而，性别决定的机制是变化多端且人们对其知之甚少。与大多数其他高度保守的发育过程相反，没有一个基因网络可以控制所有物种的性别决定。斑马鱼作为研究生物越来越受欢迎，特别是在胚胎发育研究和疾病模型方面。Cas9相关转基因技术和单细胞RNA序列分析的最新进展也为了解特定鱼类的性别决定和性腺发育的细胞事件提供了机会。这些数据使我们能够将斑马鱼中的性腺发育与其他动物中的性腺发育进行比较。

斑马鱼的性别确定和性腺发育：脊椎动物的雄性和雌性生殖道来自同一胚胎组织。 性别决定是指性腺分化为睾丸或卵巢所涉及的关键事件。在斑马鱼中，性腺的发育首先经历了卵巢样阶段。 受精后第10天（dpf），所有性腺中均可发现早期卵母细胞。虽然直到15dpf才出现有丝分裂活动的迹象，但早期的二倍体卵母细胞可以观察到一个清晰的幼年卵巢结构，这表明脊椎动物卵子早期发生。Selman等人根据斑马鱼卵巢的形态和核型，将斑马鱼的卵子发生过程分为五个阶段。基于此，性别分化的特征是出现核周卵母细胞，最早出现在17 dpf。在21 dpf时在性腺中出现这两种分化模式，而在22 dpf时一些性腺开始减数分裂。依赖于多种信号网络，大约一半的幼年卵巢维持着卵子发生的途径，另一半的个体经历凋亡，启动“幼年卵巢到睾丸”的性腺转化过程，最终转化为睾丸。到25 dpf时，仍然是双性。31 dpf可观察到性腺的三种形态，包括有核周卵母细胞的幼年卵巢、成熟卵母细胞的假定卵巢、卵母细胞凋亡并发育精原囊肿的假定睾丸。在40 dpf时，雌性性腺在卵子发生的各个阶段都含有生殖细胞，而在其他性腺中，退化卵母细胞被观察到并被认为是生精活动的第一个迹象。

图1、斑马鱼性腺发育过程中的基因网络。不同的基因在不同的阶段扮演着重要的角色，完成性别决定和性腺发育的复杂生命过程。不同颜色或形状的图形表示不同类型的细胞。

斑马鱼生殖发育的基因网络：性别确定机制主要可以分为两种，遗传性别确定（GSD）和环境性别确定（ESD）。 GSD可以具有单基因或多基因基础。XX / XY系统和ZZ / ZW系统是GSD的两个典型系统。 鱼类中存在多种性别决定机制，包括GSD，ESD或GSD-ESD相互作用。斑马鱼没有所谓的“异形性染色体”，它决定人类和其他几种物种的性别。斑马鱼表现出多基因的性别决定，也受到环境的影响。实验室品系缺乏明确的与性相关的性染色体位点，但印度的野生株在Chr4上具有位点，可作为具有环境影响的ZZ / ZW性染色体系统。研究人员已经知道环境因素，例如水温，可以改变斑马鱼种群的性别比。但是，涉及性别确定的基因网络仍然不清楚，有时还存在争议。 在这里，我们总结了对斑马鱼的性别决定和性腺发育至关重要的基因。

 生殖细胞特异性基因：

多细胞生物有性生殖需要正确的生殖细胞规格和维持。虽然生殖细胞的规格因物种而异，但分子因子基本上是保守的。vasa和dnd1（以前的名称：dnd）始终用作生殖细胞特异性标记。 在卵裂期检测到母源性vasa和dnd1。 已经表明，这两个基因的表达对于生殖细胞的迁移，存活和维持至关重要。Piwi基因已被鉴定为负责干细胞和生殖细胞分化的调节蛋白。在斑马鱼中，Piwi同源物piwil1和piwil2在雄性和雌性性腺中都表达。 piwil1在胚胎生殖和成年性腺的原代生殖细胞中表达，与vasa共定位。据Houwing等人报道，在幼虫发育过程中piwil1的缺失会触发生殖细胞凋亡。与piwil1一样，piwil2的丢失也有显著的影响，导致生殖细胞无法分化成成熟的卵母细胞或精子。编码母体mRNA的nanos1在早期胚胎发育阶段在PGC中表达，对PGC的存活和迁移至关重要。已证明Tudor结构域相关蛋白（Tdrds）充当Piwi相互作用蛋白，参与精子发生。缺乏tdrd12的鱼类显示出的生殖细胞数量减少，最终35 dpf时损失生殖细胞。 此外，在tdrd12突变体衍生的生殖细胞中也观察到减数分裂缺陷。这些基因的正确表达对PGCs的健康形成和性腺的正常发育至关重要。纯合子敲除斑马鱼或这些生殖细胞特异基因的突变体（vasa、dnd1、piwil1、piwil2、nano1和tdrd12）通常都是雄性的，睾丸呈线状；虽然这些鱼可以与雌性交配并刺激产卵，但卵没有受精。另外，ca15b在早期胚胎的PGCs中表达，其表达与vasa相似，表明ca15b是PGCs发育所必需的。另外，dyrk1a的表达始于2细胞期，并存在于斑马鱼囊胚期的所有细胞中，这与PGCs的正常形成有关。dyrk1a的过度表达导致与PGCs发育相关的两个重要因子ca15b和piwil1的表达降低，导致PGCs数量减少和迁移紊乱。斑马鱼dyrk1a与人类DYRK1A高度保守，这项工作可能为唐氏综合症患者的生殖细胞缺陷提供可能的机制。

睾丸相关基因：

睾丸的正确分化和发育是生殖的基本前提。sox9a，dmrt1，amh，ar和hsf5基因在斑马鱼的“卵巢到睾丸”阶段和睾丸成熟后期阶段中起着重要作用，所有这些对于正确分化和发展睾丸至关重要。SRY-box转录因子9a（sox9a）在斑马鱼体内的表达在18dpf时达到第一个高峰，下一个高峰与ar表达高峰在22dpf时一致，此时双潜能性腺开始向卵巢或睾丸分化。在睾丸中，sox9a被证明是amh的上游正调节剂和cyp19a1a的上游负调节剂。Webster等人证明了doublesex和与mab-3相关的转录因子1（dmrt1）对于睾丸的发育是必不可少的，但对于卵巢的发育则是不必要的； dmrt1还通过amh和foxl2基因的转录调控促进雄性发育。抗Müllerian激素（amh）是影响雄性性腺发育的重要因素。它对Müllerian导管的退行以及控制雄性生殖细胞增殖和分化的平衡具有重要意义。雄激素受体（ar）与雄激素相互作用，在雄性发育中发挥功能。 ar的转录本在16 dpf和22 dpf时达到峰值，随后在推测的雄性发育阶段均保持在较高的稳定水平，这表明它对于雄性分化和维持至关重要。Saju等。 发现热休克转录因子家族成员5（hsf5）的表达从35dpf开始增加，在雄性精子发生和生育的早期阶段起着重要作用。总之，纯合子敲除斑马鱼或这些睾丸相关基因（dmrt1、amh和ar）的突变体通常表现出雌性偏向的性别比例。特别地，sox9a的异常表达可以阻止斑马鱼幼鱼的卵巢-睾丸转化。 缺乏dmrt1表达的雄性腺会导致amh基因表达受损，从而使foxl2基因的表达不再受到限制。相反，在这些dmrt1突变体中，雌性卵巢发育正常。在纯合型amh突变雄性中，由于生殖系的不可控增殖和分化缺陷，可观察到睾丸肥大，生殖细胞增多，精子较少。无ar雄性斑马鱼具有雌性次生性特征，不育，睾丸较小，精子发生受阻。hsf5-/-突变型雄性不育，精子数量减少，精子形态异常，精子活力降低，但是雌性可育。

卵巢相关基因：

产生卵子并分泌雌激素的卵巢是雌性腺的核心。 诸如cyp19a1a，foxl2，fancl，ca15b，nanos1，nanos2和nanos3等基因共同调节卵巢的正确形成和功能。sox9a的低表达或无表达阻止双潜能性腺发育成雄性性腺；随后，性腺开始向雌性分化，cyp19a1a表达增加。cyp19a1a基因编码的芳香化酶限制了从睾丸激素向雌激素的转化速率，并且在性别分化过程中起着双重作用：cyp19a1a的低表达对于睾丸分化是必需的，而cyp19a1a的高表达对于卵巢分化和维持雌性至关重要。foxl2对于哺乳动物卵巢发育和维持至关重要。 斑马鱼中有两个foxl2同源基因，分别名为foxl2a和foxl2b。在卵巢分化和发育过程中，foxl2a的表达高于foxl2b，成熟卵巢中foxl2b的表达更为丰富。foxl2a和foxl2b的功能是相辅相成的，它们共同调节卵巢的发育和维持，而foxl2b在卵巢维持和预防转化雄性中起着更具体的作用。fancl，Fanconi / BRCA DNA修复途径的成员，在发育中的卵母细胞和精母细胞中表达。 特别是，fancl通过减数分裂使卵母细胞前进，同时维持cyp19a1a表达并下调amh表达，对卵巢的分化和发育至关重要。此外，如前所述，ca15b在早期胚胎的PGC中表达。 Wang等人还发现ca15b在成年雌性的卵母细胞中表达，这表明ca15b可能在卵子发生中具有重要作用。此外，在雌性性腺发育过程中，nanos1的表达对于维持卵母细胞的生成是必需的。nanos2和nano3对维持卵巢生殖系干细胞（GSCs）很重要。

这些卵巢相关基因的异常表达可导致各自的异常表型。cyp19a1a缺失突变斑马鱼雌激素的生物合成是有缺陷的，虽然雄性cyp19a1a突变体是可育的，但雌激素的作用会导致卵巢样性腺在性别分化过程中消失，并导致所有雄性的性别分化延迟。此外，cyp19a1a表达失调导致其他基因如sox9a、amh、dmrt1和foxl2在性腺分化期的异常表达。foxl2a突变纯合子具有正常的1：1性别比，而foxl2b破坏会导致成年雌性部分性逆转。 foxl2a-/-和foxl2b-/-突变体最初都执行正常的卵巢分化和卵母细胞发育。然而，成熟后，睾丸相关基因（sox9a、amh和dmrt1）表达增加，而与之相反，卵巢相关基因cyp19a1a在foxl2a–/–或foxl2b–/−雌性突变体中表达减少。雌性成年斑马鱼的卵巢加速老化和卵母细胞减数分裂异常，与人类患者卵巢早衰（POF）相关的情况相似。在斑马鱼中，一些foxl2b–/−纯合子雌性突变体从180 dpf开始发生性反转。此外，foxl2b基因缺陷的雌性同时出现了性反转。fancl纯合突变体由于雌雄性反转而发育为所有可育雄性。异常凋亡导致卵母细胞缺失，雌性特异性基因（如cyp19a1a）表达无法维持，雄性特异性基因（如amh）表达上调。另外，nanos1突变体雌性在受精后6个月完全不育，而nano3突变体成年雌性最初是可育的，但在5个月后转变为不育。

其他重要基因：

除上述基因外，还有一些基因在雄性和雌性斑马鱼的发育过程中起着重要作用，调节它们性腺的发育。这里我们介绍brca2、cyp17a1和cyp11c1的功能。斑马鱼fancd1（brca2）和fancl与人类FANCD1（BRCA2）和FANCL同源，在结构和功能上均保守。它们是Fanconi Anemia（FA）基因中的两个，有助于DNA修复和维持基因组稳定性。上面已经描述了fancl的功能。brca2在斑马鱼发育期卵母细胞和成熟卵母细胞中均有表达，而在睾丸中，brca2在精原细胞和发育精母细胞中均有表达，但在成熟精子中不表达。brca2是建立或维持卵母细胞核结构所必需的，对卵巢发育至关重要。所有纯合的brca2成年突变体均为男性，这是由于卵母细胞在幼年期未能通过减数分裂而进展，导致雌性至雄性逆转。

cyp17a1参与产生雌激素和雄激素的类固醇生成途径，对斑马鱼的性发育具有重要意义。雄性激素是睾丸发育所必需的，维持雄性典型的第二性征和正常的交配行为。同时，雌激素对卵巢分化是必不可少的。cyp17a1缺乏的斑马鱼都是雄性，因为雌激素的生物合成受阻。同时，雄性也表现出雌性的特征，包括浅黄色的肛鳍着色和深黑色的身体色素沉着，以及失去平行游泳和抓握的能力，导致雌性产卵失败，这是由于雄激素合成受损造成的。

斑马鱼cyp11c1编码11β-羟化酶，对11-酮睾酮（11-KT）和皮质醇的生物合成具有重要作用。Zhang等人发现cyp11c1在30和35dpf时都在睾丸和卵巢中表达，然后在45 dpf后在睾丸中特异表达。与野生型相比，cyp11c1–/−鱼类的性别比没有显著差异。

综上所述，这些优势意味着未来斑马鱼旨在了解复杂性腺发育的工作将有可能支持和改善我们的生理病理学知识，对人类具有诊断和治疗潜力。

原文出自：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2001037020303780