摘要：斑马鱼已被确定为医学研究中最重要的模式生物之一。多项研究证明人类和斑马鱼基因组之间存在高度相似性，推荐使用斑马鱼作为了解人类遗传疾病（包括癌症）的模型。斑马鱼皮肤与人类皮肤有一些相似之处表明该模式生物特别适合研究肿瘤性和炎症性皮肤病。本文评估了斑马鱼皮肤的具体特征，并描述了斑马鱼模型在皮肤病学研究中的主要应用。

简介：动物模型系统提供了一种技术手段来进行人类受试者无法进行的研究，为理解人类生理学和病理生理学提供了宝贵的钥匙。其不仅可以进行更先进的药代动力学和药效学研究还可以发现治疗人类疾病的新方法。由于其与人类众所周知的生理和遗传相似性，小鼠和其他哺乳动物模型已被常规用于医学研究。与传统模型相比，其他动物模型显示出明显的优势。近年来对该领域的兴趣有所增加。鱼类似乎是迄今为止研究的动物模型中最有趣的非哺乳动物脊椎动物模型，维护成本低且允许体内成像。Platyfish (Xiphophorus) 和 Medaka (Oryzias latipes) 已成功用作黑色素瘤模型。20世纪80年代初，Streisinger 及其同事首次引入斑马鱼模型进行遗传研究。

斑马鱼是小型脊椎动物热带鱼被用作反向和正向遗传研究，其特点是维护成本低。斑马鱼被用作正向遗传研究模型（通过观察某种表型来识别特定基因型）。使用点突变进行正向遗传筛选既耗时又费力。近年来越来越先进的技术已经克服了使用斑马鱼创建多种疾病模型的挑战，并通过反向遗传学（观察已知基因型产生的表型）扩大了斑马鱼研究。超过 80% 的已知人类疾病基因包括癌基因和肿瘤抑制基因，斑马鱼都有其直系同源物。并且一些途径也是保守的，即使是与致癌有关的途径。所有这些特征和证据促进了斑马鱼作为理解人类遗传疾病（包括癌症）模型的使用并指出了其在体内筛选新疗法的潜力对个性化医疗时代尤为重要。尽管小鼠模型仍然是医学研究领域中最常用的模型，但斑马鱼具有小鼠模型所没有的一些优势和独特特征。

斑马鱼皮肤：鱼皮包括表皮、真皮和皮下组织类似于哺乳动物的皮肤。与表皮被角质化的死细胞外层覆盖的哺乳动物和陆生脊椎动物的表皮不同，斑马鱼的皮肤表面没有角质层是由被粘液覆盖的活细胞组成。此外，斑马鱼没有哺乳动物的皮肤附属器，无法检测到毛囊和皮脂腺。哺乳动物表皮是一种组织良好的分层组织，包括从基底膜到皮肤表面的基底细胞、棘细胞、颗粒细胞和角质细胞。 硬骨鱼表皮只有三层，表层是单细胞层，其中细胞富含角蛋白丝，在死亡时不断被替换不会产生角质层。中间层由不同的细胞类型组成，包括单细胞腺体（粘液细胞和棒状细胞）、感觉细胞、离子细胞和未分化细胞。 基底层是一个单细胞层，通过半桥粒与基底膜相连，半桥粒将表皮与真皮紧密连接。

斑马鱼从胚胎成熟到完全发育的鱼只需要几天时间。 在受精后一天（dpf）已经可以检测到代表表皮和真皮层。成年斑马鱼覆盖表皮的鳞片在30 dpf左右形成，已经确定音猬因子途径在其发育中起作用。胶原基质的形成依赖于成纤维细胞，而色素的产生来自黑素细胞，属于神经嵴衍生的色素细胞系统。一些表皮标记基因，包括角蛋白 1 和 5、230 kDa 大疱性类天疱疮抗原、plectin 和一些皮肤基底膜区（BMZ）基因，包括 IV、VII 和 XVII 型胶原蛋白，在斑马鱼皮肤的早期发育阶段表达。大多数表达的I、V 和 VI人类胶原蛋白类型可在6 dpf斑马鱼皮肤中检测到。与皮肤发育有关的斑马鱼基因库与人类皮肤有很强的相似性。斑马鱼的神经嵴产生三种不同的色素细胞：黑素细胞、黄素细胞和虹彩细胞。黑素细胞合成黑色素，类似于脊椎动物的黑素细胞，黄素细胞含有蝶啶色素引起黄色外观，虹彩细胞形成有反射光的虹彩外观。受精后约24小时，来自神经嵴的黑素祖细胞首先在色素细胞中形成黑素小体。

图1、斑马鱼和人类皮肤的比较。

与哺乳动物黑色素细胞一样，酪氨酸蛋白激酶 KIT 在胚胎前两天促进黑色素细胞的初始迁移方面发挥着重要作用。在斑马鱼幼虫发育后期，一组新的黑素细胞有助于形成斑马鱼条纹特征。

斑马鱼皮肤炎症：皮肤对于保护鱼类免受环境应激因素至关重要。 由于鱼是变温动物，即使外部参数的微小变化也可能导致损伤和炎症。一系列上皮细胞、常驻非免疫细胞、血管内皮细胞和粘膜上皮细胞有助于启动和协调炎症反应。有趣的是，与人类不同，鱼没有大量的淋巴积聚。目前尚不清楚鱼皮肤的淋巴细胞存在于何处。 最可能的理论是鱼类白细胞通过粘液分泌物迁移到皮肤以响应损伤刺激。炎症通路在哺乳动物和鱼类中均受 NF-κB 家族转录因子的调节，经典的促炎细胞因子如 IL-1β、TNF-α 和 IL-6 在大多数硬骨鱼中占主导地位，因此这两种动物的主要炎症机制相似。中性粒细胞在启动哺乳动物和斑马鱼的炎症反应以及炎症的发生中起着重要作用，尤其是通过 TNF-α 和 IL-1β。一旦被激活，单核细胞分化为典型的促炎巨噬细胞，作为抗原呈递细胞发挥作用，并产生活性氧（ROS）、TNF-α和IL-1β。中性粒细胞活化决定了其颗粒的胞吐作用。 中性粒细胞也招募抗原呈递细胞，例如树突细胞、巨噬细胞和内皮细胞。虽然哺乳动物的白细胞起源于骨髓并在淋巴结中成熟，但斑马鱼缺乏这种结构。头肾中有骨髓对应物，作为主要的造血和淋巴器官。事实上，鱼类和哺乳动物共享胸腺、脾脏和粘膜相关淋巴组织（MALT）。利用荧光研究了斑马鱼皮肤中免疫细胞的迁移和增殖，诱导了与炎症相关的皮肤基因的荧光早期表达。

斑马鱼肿瘤模型：肿瘤学领域的最大障碍之一是解决个体间差异或肿瘤内环境中的癌症异质性。癌症研究的创新很大程度上得益于在活体动物中进一步探索这些过程。通过大规模药物（小分子）筛选，患者来源的癌细胞异种移植 (PDX) 可以帮助克服肿瘤细胞增加的突变而导致的治疗耐药性。这一过程在小鼠模型中不像鱼类等非哺乳动物模型那样容易实现因为小鼠PDX需要受体免疫抑制。与人类相比，斑马鱼的癌症信号通路高度保守。斑马鱼是一种多功能模型，因为可以在特定基因中操作突变，从而产生稳定的转基因，或产生特定基因的瞬时过表达或下调。 斑马鱼也可以进行正向和反向遗传筛选。斑马鱼已被用于正向遗传筛选，以测试诱变剂对肿瘤发育的影响。导致 tp53 突变的乙基亚硝基脲筛选是癌症发病机制研究中最多的基因之一，是斑马鱼在肿瘤学领域的首批实验之一。随后引入了进一步的技术，这有助于斑马鱼的癌症研究取得进展。目的是创建功能丧失表型或将通常在人类癌症中发生突变的转基因引入鱼类模型。许多突变的肿瘤抑制基因，如Tp53，以及癌基因，如mMyc和KRas，可以在斑马鱼中产生与在人类身上观察到的相同的平行肿瘤。揭示了人和鱼之间肿瘤发生驱动因素和途径的进化保守性。斑马鱼最常用的基因操纵技术是MOs、ZFN、TALENs和CRISPR。最近引入了新的有前途的技术用于斑马鱼，例如 TEAZ（成年斑马鱼的转基因电穿孔）和肿瘤细胞移植，特别是 PDX 的形式。

斑马鱼黑色素瘤模型：自首次描述 BRAF V600E 模型以来，黑色素瘤无疑是斑马鱼中研究最多的癌症和分析最多的皮肤癌之一。 在大约 43-50% 的黑色素瘤中发现V600E 突变，一种关键的黑色素瘤驱动因子也经常在不会进展为癌症的良性痣和痣中发现。肿瘤抑制基因p53（p53−/−）的功能丧失是痣进展为癌症所必需的。携带 BRAF V600E 和 p53-/- 突变的斑马鱼黑色素瘤形成时间长且罕见，这意味着还有其他分子改变和途径在黑色素瘤形成中起作用。基于斑马鱼黑色素瘤中表达了通常仅限于发育中斑马鱼胚胎中的神经嵴祖细胞的crestin，进行了在crestin控制下表达GFP（绿色荧光蛋白）的转基因斑马鱼的研究。GFP 阳性细胞表明，只有重新激活 crestin 的单个黑色素细胞才能引发黑色素瘤。与crestin表达一致的是SOX10转录因子的表达，SOX10是一种保守的早期神经嵴标记，有助于黑素细胞重新编程到胚胎状态。神经嵴基因如 crestin（在斑马鱼黑色素瘤中）和 SOX10（在斑马鱼以及人类黑色素瘤细胞系中）的重新激活可能是组蛋白表观遗传修饰的结果。N-RAS 突变也在斑马鱼中进行了研究，其表达导致斑马鱼全身色素沉着过度。当 p53 突变被添加到突变的 N-RAS 中时，鱼会产生侵袭性黑色素瘤，这些黑色素瘤在组织学和遗传上与人类黑色素瘤相关。虽然黑色素瘤的发生率低于前面提到的 BRAF 和 N-RAS 突变，但 H-RAS 突变的斑马鱼模型也显示出黑色素瘤的发展。

斑马鱼鳞状细胞癌模型：尽管与黑色素瘤相比，鱼类中的非黑色素瘤皮肤癌不太常见，但斑马鱼也已被充分用作研究此类癌症潜在发病机制的模型。采用鳞状细胞癌异种斑马鱼移植模型已经确定了参与鳞状细胞瘤（SCC）发病机制的关键分子以及可能用作SCC治疗靶点的化合物。作为治疗靶点进行研究的关键分子是酪氨酸激酶受体 Axl，它在 SCC 中高度表达。其他重要的靶点是 COL7A1 基因，它负责在大疱性表皮松解症中发展侵袭性 SCC以及重组VII型胶原（hrCol7），它能够逆转斑马鱼模型中的SCC血管生成。另一项有趣的体内异种移植模型研究分析了酪氨酸激酶盘状结构域受体 2 (DDR2) 在头颈部鳞状细胞癌 (HNSCC) 细胞增殖、粘附、分化和侵袭中的作用。另一种治疗HNSCC的潜在化合物是海洋微生物提取物luminacin。斑马鱼胚胎的研究表明luminacin治疗肿瘤细胞刺激SCC细胞系的自噬从而抑制肿瘤生长和进展。斑马鱼模型也表明KB细胞中FLOTILIN-1的过度表达促进了KB细胞的运动和细胞生长。这些研究证明斑马鱼模型不仅可用于评估SCC发生和发展的分子途径，还可用于药物毒性和筛选试验。

斑马鱼的其他皮肤病学应用：斑马鱼不仅可用于研究源自黑色素细胞的癌症，还可以研究其他黑色素生成障碍，因为斑马鱼和哺乳动物之间的黑色素生成途径是保守的。通过研究斑马鱼白化病模型可以阐明基因的功能，这些基因在这种疾病的发病机制中的作用可能尚未被认为与人类白化病有关。正确的基因诊断可能对治疗不同但临床上往往无法区分的白化病至关重要。基因功能的快速 CRISPR 筛选使斑马鱼成为发现白化病基因的绝佳模型。尽管违反直觉，斑马鱼白化模型也有助于阐明黑素瘤中癌性黑素细胞的化疗耐药机制。使用MOs研究遗传性色素障碍以确定先前在受影响个体中鉴定的特定基因的功能。蛋白质O-岩藻糖基转移酶1（pofut1）和早老素增强子-2（psenen）敲除斑马鱼均显示色素沉着的异常分布，从而证实上述基因参与Dowling-Degos综合征的某些临床表现。此外，还创建了oca2突变斑马鱼和c10orf11敲除斑马鱼以在体内探索眼皮肤白化病相关基因功能，确认涉及整个鱼类、小鼠和人类的保守基因功能。

图2、斑马鱼在皮肤生物学中的应用

结论：炎症性和肿瘤性皮肤病非常常见，并且在全球范围内呈上升趋势。斑马鱼可以作为合适的动物模型以扩大我们对皮肤疾病的分子和细胞机制的理解并在皮肤病学中开发新的治疗策略。由于其低维护成本、高度保守的基因组和易于遗传操作，斑马鱼是皮肤科实验室临床前研究的优秀模型，填补了体外细胞培养和体内哺乳动物模型之间的空白。

原文出自：The Zebrafish model in dermatology: an update for clinicians | SpringerLink