摘要：斑马鱼是模拟人类疾病的重要动物系统。 这包括肾功能障碍，因为胚胎肾（前肾）与人类肾单位在分子和形态方面同源性高。肾病的一个关键临床指标是蛋白尿，但目前缺乏斑马鱼蛋白尿的高通量判读。为了解决这个问题，我们使用Tol2转座子系统生成了转基因斑马鱼系，该系使用fabp10a肝特异性启动子过度表达与受体相关蛋白D3结构域融合的纳米荧光素酶分子（一种分子伴侣），我们称之为NL-D3，我们通过测量胚胎培养基中的发光强度来定量NL-D3斑马鱼仔鱼的蛋白尿。使用光度计，通过测量胚胎培养基中的发光强度来量化 NL-D3 斑马鱼仔鱼中的蛋白尿。在健康状态下，NL-D3 不会被排出，但是当用影响近端肾小管重吸收（顺铂、庆大霉素）或肾小球滤过（血管紧张素 II、汉克斯平衡盐溶液、牛血清白蛋白）的化学物质处理胚胎时，在鱼培养基中检测到NL-D3。类似地，与肾脏疾病相关的几种基因产物（nphs1、nphs2、lrp2a、ocrl、col4a3和col4a4）的缺失也诱导了NL-D3蛋白尿。用卡托普利治疗缺乏col4a4的斑马鱼仔鱼（Alport综合征模型）可减少蛋白尿。研究结果证实了NL-D3转基因斑马鱼作为一种稳健和可量化的蛋白尿报告品系的使用。鉴于斑马鱼高通量检测的可行性，NL-D3转基因斑马鱼将允许筛选改善蛋白尿的药物，从而优先考虑进一步转化研究的候选药物。

关键词：Alport综合征  基底膜  肾小球  蛋白尿  近端小管  IV型胶原   斑马鱼

蛋白尿是肾脏疾病的重要临床指标。 使用尿液试纸，可以在几秒钟内确定尿液中是否存在蛋白质。对尿液中蛋白质分子大小的进一步评估表明肾单位功能缺陷的位置。尿液中大蛋白的存在表明肾小球滤过器功能紊乱，而低分子量蛋白的存在则表明近端小管功能紊乱。斑马鱼是研究肾脏发育和疾病的流行模式生物，但目前缺乏蛋白尿的定量报告。胚胎斑马鱼发育出一个功能正常的前肾，其分子和结构与人类肾单位相似。前肾由单个中线融合肾小球组成，附着于双侧小管，沿其前后轴分割为不同的近端和远端区域。测定斑马鱼胚胎肾功能的最佳方法是使用不同分子量的荧光右旋糖酐来区分肾小球和近端小管功能障碍。荧光右旋糖酐对蛋白质内吞的细胞机制没有特异性；这些方法是有用的，但它们不是定量的，且不能以高通量方式使用，不能特异性识别近端小管中巨蛋白介导的内吞缺陷。斑马鱼转基因报告基因品系(fabp10a:½vdbp-mCherry) 使胚胎培养基能够被收集并检测低分子量蛋白质。这一功能强大的系统允许定量蛋白尿作为近端小管中lrp2/巨蛋白内吞途径功能障碍的判读。通过免疫荧光成像或酶联免疫吸附测定，报告近端小管功能障碍，以量化近端小管中的蛋白摄取和蛋白尿。这种遗传工具突出了转基因在斑马鱼中开发蛋白尿报告基因的潜力。我们描述了一种新的基于纳米荧光素酶（NL）的斑马鱼蛋白尿报告基因。胚胎培养基中排泄的NL蛋白在添加其底物荧光素后通过发光检测。利用这一新系统可以高通量方式测定近端肾小管和肾小球功能的变化。

体外重组 NL-D3 可被内吞：目的是开发一种转基因报告基因来研究斑马鱼前肾近端小管的内吞作用。近端小管内吞途径的一个重要组成部分是具有多个配体的600 kDa巨蛋白受体。巨蛋白的功能和加工依赖于受体相关蛋白，该蛋白包含与巨蛋白具有不同亲和力的三维结构域。我们将大鼠受体相关蛋白与NL融合。全长受体相关蛋白-NL融合产生大小为58kDa的蛋白。假设限制报告蛋白的大小有助于其通过肾小球毛细血管壁，因此我们将受体相关蛋白的14 kDa D3结构域融合到NL的C端，以产生NL-D3，其预测大小为35.5 kDa。我们首先想确认 NL-D3 融合蛋白可以报告巨蛋白依赖性内吞作用。在大肠杆菌中表达重组 NL-D3，并分离纯化蛋白质。然后将重组NL-D3用于HEK293细胞的摄取实验，该细胞稳定表达截短的megalin。通过裂解细胞并测量发光来测量摄取，与用重组NL-D3孵育的对照HEK293细胞相比，用重组NL3-D3培养的HEK293-MmR4细胞具有大约10倍高的摄取水平。对照HEK293细胞和HEK293-MmR4细胞在与NL孵育后均未显示发光。这些体外结果表明 NL-D3 与巨蛋白结合并容易被内吞。

图1. NL-D3被巨蛋白内吞途径摄取。

γ-crystallin:mcherry/fabp10a:NL-D3斑马鱼：为了开发一种可行的近端小管内吞作用的体内报告者，我们转向斑马鱼模型。使用多功能 Tol2 基因转移系统生成转基因斑马鱼，在肝脏特异性 fabp10a 启动子的控制下表达 NL-D3。为了进行选择，转座因子在γ-晶体蛋白启动子的控制下双重表达McHery。5-dpf的转基因的γ-crystallin:mcherry/fabp10a:NL-D3斑马鱼（下文称为NL-D3）的全胚胎裂解物的发光比野生型胚胎高约100000倍。成年期NL-D3报告鱼分离的血液中观察到类似的发光增加。还测量了成年期器官组织中NL-D3的含量，肝脏的发光最多。转基因斑马鱼中NL-D3的肝脏特异性表达导致该报告物强烈释放到血管系统中。培育了多代NL-D3转基因斑马鱼，没有观察到对鱼类整体健康或寿命的任何影响。NL-D3斑马鱼和年龄匹配对照组肝脏的组织学分析显示无明显变化。

NL-D3 胚胎检测近端小管功能障碍：为了测试 NL-D3 是否通过肾小球滤器并被前肾近端小管中的巨蛋白内吞途径重吸收。近端小管对10 kDa荧光右旋糖酐的再摄取评分为正常、低或无。与对照组（n=40）相比，lrp2a的缺失足以严重减少近端小管中10 kDa荧光右旋糖酐的摄取（n=39）。将4 dpf的lrp2a变体置于96孔板的1孔中，更换胚胎培养基，用光度计测量胚胎培养基中的NL-D3含量。与每孔 1 个胚胎相比，每孔 3 个胚胎（n = 9孔）在发光测量中产生的变异性较小。还测量了1小时、4小时、8小时和24小时取自lrp2a变体的胚胎培养基的发光（每个时间点n=9）。NL-D3 报告基因的灵敏度足以在短短 1 小时后评估蛋白尿，但对照和实验样品之间的分离在 24 小时时最大。我们在所有的分析中都使用了这个时间点。使用重组NL-D3生成的标准曲线，将从光度计获得的相对发光单位定量转换为NL-D3量（ng/ml）。lrp2a的缺失导致胚胎培养基中存在的NL-D3增加约29倍。另一种与近端小管内吞作用有关的基因产物是OCRL，致病性变体导致Lowe综合征，与低分子量蛋白尿相关。我们还测试了靶向近端小管并诱导蛋白尿的肾毒素的作用。庆大霉素和顺铂是 2 种公认的肾毒素药物，主要通过近端小管细胞死亡引起肾脏损伤，以前曾用于消融斑马鱼近端小管上皮。胚胎培养基中 NL-D3 分泌的分析表明，与赋形剂对照相比，0.5 nl  6 ng/μl 庆大霉素使蛋白尿增加约 13 倍。用双倍量的庆大霉素处理胚胎使蛋白尿进一步增加至对照（n = 12）的约 534 倍，表明在 NL-D3 报告基因中可检测到剂量反应。顺铂也获得了类似的剂量反应，低剂量（0.5mM）导致蛋白尿增加约1.5倍，高剂量（1.5mM）引起约6.7倍。这些结果证实了NL-D3转基因鱼是一种可行的工具，用于检测近端肾小管功能障碍引起的蛋白尿。

图 2. NL-D3 斑马鱼可用于检测近端小管功能障碍。

NL-D3胚胎检测肾小球功能障碍：我们进一步分析了干扰肾小球特异性基因表达的影响，以确定 NL-D3 报告基因是否也可用于测量与肾小球功能障碍相关的蛋白尿。NPHS1 和 NPHS2 编码建立足细胞裂孔隔膜的蛋白质。这些基因的致病性变异导致肾病综合征，其特征是蛋白尿过多。使用与 Fukuyo 等人使用的相同的吗啉代寡核苷酸，我们观察到 500 kDa 异硫氰酸荧光素缀合的葡聚糖从脉管系统中清除，证实吗啉代会导致肾小球功能障碍。这些结果表明，NL-D3报告基因作为肾小球和近端肾小管功能障碍的双重报告基因。对斑马鱼前肾肾小球发育的透射电子显微镜分析表明，在大约 4 dpf 时建立了完全形成的过滤屏障。前肾小管的分化早于此，受精后48小时出现刷状边缘和近端-远端分割。测试了NL-D3报告基因是否可以在早期发育阶段用于检测与近端小管功能障碍或肾小球功能障碍相关的蛋白尿。发现在对照组（n=20）、nphs1变体（n=16）、lrp2a变体（n=12）或ocrl变体中，在24和48 hpf之间的报告者中均未检测到肾小管或肾小球相关蛋白尿。

图3.NL-D3斑马鱼也可用于研究肾小球疾病。

斑马鱼colIV基因的表达分析：鉴于与肾小球病理相关的肾脏疾病过多，NL-D3斑马鱼系测量肾小球功能障碍的潜力令人感兴趣。其中一种情况是阿尔波特综合征，由人类COL4A3、COL4A4或COL4A5的变异引起。COL4A3、COL4A4或COL4A5的变体导致GBM中胶原a3a4a5（IV）减少或缺失，影响其长期功能。阿尔波特综合征患者最初出现微量血尿，随后出现蛋白尿，肾功能逐渐下降，导致肾衰竭。斑马鱼肾小球中 IV 型胶原蛋白链的表达谱以前没有被表征过。 斑马鱼有 6 个 IV 型胶原基因 col4a1-a6，它们是人类中发现的 6 个 IV 型胶原基因 (COL4A1-A6) 的直系同源物。进行了原位杂交以检测4dpf斑马鱼胚胎中col4a1–a6转录物的空间组织，这是肾小球完全发育的时间点。预期col4a1和col4a2的表达谱是相同的，因为脊椎动物IV型胶原基因的表达是通过col4a1/col4a2、col4a3/COL4B4和COL4B5/COL4S6的假定双向启动子调控的。在血管系统中检测到 col4a1 和 col4a2 转录物，最显著的是在主动脉弓、中央动脉和头部区域的原始后脑通道中。在横切胚胎中清楚地观察到 col4a1 的肾小球定位。与 col4a1 和 col4a2 相比，col4a3 和 col4a4 表达谱受到更多限制。在晶状体囊和肾小球中观察到col4a3和col4a4的高水平表达，在鳃弓中检测到弱表达。使用原位杂交，我们无法检测肾小球中col4a5的表达，尽管使用了不同的探针。

图4. 斑马鱼肾小球中表达IV型胶原

鉴于斑马鱼 NL-D3 转基因报告系可用于检测肾小球功能障碍，其中蛋白尿是关键临床特征，例如在 Alport 综合征中，我们接下来尝试使用化学方法挽救肾小球滤过以确定该系统用于复合筛选的潜力。col4a4 crispants被用作阿尔波特综合征的模型。对3 dpf至5 dpf的col4a4 crispants施用卡托普利来降低全身血压，我们测定了4 dpf至5dpf的蛋白尿。卡托普利是一种血管紧张素转换酶抑制剂，以前曾用于斑马鱼以降低血压。假设降低全身血压也会降低肾小球内压。我们发现卡托普利治疗对未注射的斑马鱼胚胎没有影响，但几乎完全防止了col4a4 crispants的蛋白尿。使用2,3-丁二酮2-单肟降低3 dpf至5 dpf斑马鱼胚胎的心率。假设较低的心率会导致肾小球灌注减少，从而减少肾小球滤过。野生型斑马鱼胚胎剂量反应分析表明，浓度为7.5μM的2,3-丁二酮2-单肟足以显著降低心率。血管紧张素 II 是一种肽激素，可通过诱导血管收缩来增加血压。发现 0.5 μM 血管紧张素 II 不会导致 NL-D3 胚胎出现蛋白尿； 然而，5 μM 血管紧张素 II 导致蛋白尿增加约 3.4 倍（n = 12）。注射 Hanks 平衡盐溶液或 10% 牛血清白蛋白会导致 NL-D3 报告胚胎中的蛋白尿急剧增加。汉克斯平衡盐溶液是一种盐水溶液，注射时会导致水流入血管系统，并已被证明会扩张肾小球毛细血管。假设注射 Hanks 平衡盐溶液会在肾小球中产生急性机械负荷从而导致蛋白尿。，我们观察到 500 kDa 荧光素异硫氰酸酯共轭葡聚糖的清除率增加支持这一点。我们检测到Hanks平衡盐溶液注射的 NL-D3 胚胎发光增加了大约 128 倍。这些数据证实NL-D3报告系可以检测与全身血压和肾小球灌注变化相关的蛋白尿。他们还强调了这一新工具在肾功能治疗筛查中的潜力。

结论：我们的数据显示了基于 NL 的斑马鱼品系蛋白尿报告基因的开发。 鉴于该系统在实验可用性和高通量筛选的可行性方面的优势，预计这种新的蛋白尿报告基因将成为肾脏研究人员工具包的宝贵补充。

原文出自：A novel nanoluciferase transgenic reporter measures proteinuria in zebrafish - ScienceDirect