长期和短期接触碳纳米颗粒 (CNP) 会影响胎儿发育和随后的不良后果，包括早产、宫内生长受限、低出生体重、与成年期心血管、呼吸和神经系统相关的健康风险增加。CNPs 的不良发育结果是众所周知的，但其潜在机制仍未知。 本研究用50、100、200μg/mL的CNPs处理斑马鱼胚胎，观察其毒性作用。使用 RNA-seq 分析方法，我们研究了 CNP（200 μg/mL）对受精后 4 到 96 小时（hpf）暴露的斑马鱼胚胎基因表达的影响。我们观察到CNPs处理的胚胎畸形增加，孵化减少。转录组分析共检测到236个差异表达基因，这些基因与光转导、氨基酸代谢、类固醇和类固醇激素生物合成有关。通过实时荧光定量 PCR (RT-qPCR) 验证转录组结果。 我们的研究结果表明，CNPs 暴露最有可能导致类固醇和激素生物合成途径中的差异基因变化，从而诱导发育毒性，例如斑马鱼胚胎的延迟孵化、畸形率增加和多种畸形表型。

关键词：碳纳米颗粒  斑马鱼胚胎  转录组分析  发育毒性  畸形表型

简介：黑碳（BC）存在于细颗粒和超细颗粒的大气颗粒中，主要粒径小于1µm，主要粒径小于0.18µm。一些研究发现，环境空气中的纳米BC颗粒很容易进入人体，并迁移到更深的循环系统中。例如，Maher等人在尸检大脑样本的额叶皮质中检测到了来自空气污染的燃烧衍生纳米颗粒。此外，在所有受试儿童的尿液中检测到BC，总平均值（SD）为98.2×105（29.8×105）粒/毫升。在所有筛查的胎盘中都发现了 BC，低暴露和高暴露女性的平均 (SD) 粒子计数分别为 0.95 × 104 (0.66 × 104) 和 2.09 × 104 (0.9 × 104) /mm3 粒子。胎盘BC负荷与孕妇在妊娠期间的家庭BC暴露呈正相关。为了研究长期暴露于碳纳米颗粒 (CNP) 对生物体的影响，Wistar 大鼠被重复腹膜内注射 给药4 周。注射前，将纯粉末纳米粒子以 500 mg/L 的浓度悬浮在无菌盐水溶液中。 结果表明，纳米粒子在注射部位附近的腹腔内主要以聚集体形式存在，肝脏的肠系膜和浆膜也观察到了小的聚集体，表明纳米粒子可能已经转移到肝脏。另一项研究使用鸡胚模型，通过将浓度为 500 μg/mL 的实验溶液注射到卵白蛋白中来研究六种不同类型 CNP 的毒性。孵育5、10、15和20天后观察大体病理学和存活率。 培养 20 天后，采集血样并测量器官重量。结果表明，CNPs能降低胚胎的相对存活率，并在循环中存活，无明显副作用，值得进一步研究。因此，公众越来越关注含BC的CNP的安全性，需要对这些纳米大气颗粒物进行全面的毒性评估。

胎儿发育是暴露相关易感性的一个关键窗口。 成年期疾病的病因可能源于胎儿，并可能归因于宫内环境暴露的不利影响。例如，暴露于燃烧相关的大气颗粒物污染（包括BC）与早产和宫内生长受限有关。此外，围产期接触 BC 也会在成年后诱发一系列疾病。 斑马鱼胚胎是探索发育毒理学机制的最有希望的模型之一。为了研究氧化锆纳米颗粒（ZrO2 NPs）对胚胎发育的影响，斑马鱼胚胎在受精后24–96 hpf内注射0.5、1、2、3、4或5μg/mL的ZrO2 NPs。结果表明，0.5～1 μg/mL的浓度可引起胚胎急性发育毒性，并观察到胚胎死亡、孵化延迟和畸形。暴露于ZrO2NPs会导致轴向弯曲、尾部弯曲、脊髓弯曲、卵黄囊和心包水肿。另一项研究调查了 CuO NPs 对斑马鱼胚胎的发育毒性。 受精后 4 小时至 96 hpf的斑马鱼胚胎暴露于不同浓度的 CuO NPs (0.5, 1,1.5 mg/L)。结果表明，CuO NPs 不能进入斑马鱼胚胎组织，但可能导致死亡率增加、孵化延迟和心率下降。此外，CuO NP可导致头尾畸形、脊椎畸形、卵黄囊水肿、心包水肿和其他类型的异常。暴露于 30 μg/mL CNPs 60 天，已观察到成年斑马鱼心脏组织中吸收的碳颗粒的位置，并证明了含有 BC 的 CNPs 对斑马鱼心脏的潜在慢性影响。然而，BC 和含 BC 的 CNP 暴露影响胚胎发育的机制仍不清楚。因此，该研究选择斑马鱼胚胎作为实验对象，购买CNPs作为实验室替代品，以替代真实世界中含有BC的CNPs。斑马鱼胚胎在24、48、72和96hpf的孵化率和畸形指数被认为是在暴露于CNPs后检测到的。 此外，对对照组和暴露于 200 μg/mL CNPs 的斑马鱼进行了转录组比较，以更好地了解差异表达基因 (DEGs) 和 CNPs 诱导胚胎发育毒性的潜在机制路径。

CNPs对斑马鱼胚胎的毒性作用：48hpf对照组的孵化率为19.17%，而50、100和200 μg/mL浓度组的孵化率分别为5.83%、5.00%和2.50%，显着低于对照组。72hpf对照组的孵化率为89.17%，而50、100和200μg/mL浓度组的孵化率分别为52.50%、48.33%和48.33%，也显著低于对照组。此外，50、100和200μg/mL（96hpf）的畸形率分别为39.02%、50.68%和77.14%。已发现畸形胚胎，包括眼发育不全、心包水肿、血液循环障碍、卵黄囊畸形、脊索弯曲、尾巴弯曲、黑素细胞减少、心跳减慢，畸形数量随着剂量和时间的增加而增加。在200μg/mL浓度组中，眼部发育不良、卵黄囊畸形和血液循环障碍等畸形的数量显著高于其他组。仅在最高浓度组观察到对触摸无反应的异常现象。

图1、不同浓度组斑马鱼的孵化率和畸形率。（a）不同浓度组的48hpf和72hpf孵化率。（b） 不同浓度组的96hpf畸形率。

图 2、 96 hpf 时暴露于 50,100,200 μg/mL CNPs 引起的表型变化。

图 3、96 hpf 暴露于 CNP 的斑马鱼胚胎不同类型畸形的数量。

CNPs对基因表达的影响：RNA-seq 数据显示，在 200 μg/mL CNP 和对照组中，从胚胎样本中获得的平均无污染读数分别为 21876005 和 22549680。两个样本的平均基数比 6 G 更显著。总的来说，这些结果表明数据质量可以满足进一步的分析。对暴露于CNPs的正常斑马鱼胚胎进行RNA-seq和基因表达谱分析表明，共有236个基因差异表达，其中102个基因显著减少，134个基因显著增加。然后，对所有发生显著变化的DEG进行GO富集分析和进一步的KEGG富集分析。DEGs的显著富集有几个GO术语，包括“生长”、“节律过程”、“细胞外区域”、“抗氧化活性”和“解毒”。为了更好地研究 CNPs 对斑马鱼差异基因表达的调控，基于 KEGG 通路数据库，DEGs 在功能上被归类为典型的信号通路。根据top值，“光转导”、“甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢”、“丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢”、“类固醇生物合成”、“类固醇激素生物合成”是主要的显著调节途径。KEGG富集网络图显示，CNPs破坏了斑马鱼胚胎光转导途径中的基因表达，包括两个上调基因（enam、guca1e）和四个下调基因（guca1c、loc110437775、opn1mw2），以及7个氨基酸代谢途径中的差异表达基因，包括5个下调基因（ASN、abat、psat1、gcshb、pipox）和2个上调基因（gls2b、agxtb）。此外，类固醇生物合成和类固醇激素生物合成途径中有7个差异表达基因。 其中，上调基因为hsd17b7、cyp3a65、cyp51和sqlea，下调基因为cyp1a、sult5a1、ugt2b3。

图 4. 96hpf 暴露于 200 μg/mL 的 CNP 的转录组分析。

通过 RT-qPCR 验证 DEG：选择富含类固醇生物合成和类固醇激素生物合成途径的DEGs，从RNA-Seq结果中选择7个基因（sult5a1、sqla、ugt2b3、hsd17b7、cyp1a、cyp3a65和cyp51）的表达，通过qRT-PCR检测验证 RNA-Seq 数据。如图 5 所示，对于上调和下调基因，qPCR 的结果与 RNA-seq 的结果非常吻合。

图5、类固醇生物合成和类固醇激素生物合成信号通路中关键基因的表达和验证。

讨论：不同浓度的 CNPs 可诱导显着的发育毒性。 与对照组相比，CNPs显着干扰斑马鱼胚胎的正常发育，且孵化延迟和致畸作用呈时间和剂量依赖性。类似的研究表明，丁二烯烟灰 (BDS) 纳米颗粒可能导致斑马鱼发育毒性，包括心包水肿、卵黄囊肿胀、轴向畸形。在这项研究中，观察到卵黄囊畸形，这可能会影响营养代谢，从而影响胚胎发育。 在蛋黄发育过程中，胚胎可以利用蛋黄中积累的内源性营养物质。在鱼卵中，内源性脂质储备，主要是磷脂和三甘油，以卵黄球的形式存在。对卵黄囊的影响也可能是由于脂质合成和代谢的改变。卵黄囊的任何损伤都可能阻碍胚胎发育期间的营养供应，这可能是异常发育的原因。结果表明，在CNPs诱导的斑马鱼胚胎发育毒性的许多异常表型中，48/72/96 hpf发现脊索弯曲呈剂量依赖性。脊索弯曲是本研究中观察到的最重要的表型变化之一，可能导致胚胎骨骼畸形。心脏发育是胚胎发生的重要终点。 在我们的研究中，我们发现斑马鱼胚胎有心包水肿和心脏血液循环障碍。2019年的一项研究表明，CNPs可以引起心肌组织显着的超微结构变化，并以剂量依赖性方式诱导炎症因子的表达，导致心内膜下炎症和细胞凋亡。此外，本研究观察到斑马鱼眼发育不全，可能影响斑马鱼的视觉发育。RNA-Seq 分析表明，光转导、氨基酸代谢、类固醇和类固醇激素生物合成途径比其他途径显着富集了更多的 DEG。在实验中，CNPs溶液呈黑色，尤其是浓度越高，CNPs溶液的颜色越深，这表明暴露组和对照组的光线不同。光在斑马鱼的发育中起着重要作用，影响视网膜的总厚度和感光细胞层的厚度，从而影响视觉的发展。色素减退是斑马鱼在没有光照条件下发育时通常发生的一种变化。其他研究强调，暴露于斑马鱼胚胎/幼虫中的污染物可能会改变与发育性眼病相关的晶体蛋白基因的基因表达水平。此外，暴露于氯氰菊酯48小时后，斑马鱼幼虫的眼睛发育毒性可能会改变与视觉相关的基因，扰乱斑马鱼胚胎的光诱导途径。在本研究中，我们观察到斑马鱼的眼部发育不良和黑素细胞减少，以及光转导途径的异常表达，这表明应使用敲除模型动物来探索毒性效应与机制途径之间的关系。

类固醇和激素生物合成途径是斑马鱼胚胎发育、代谢和内分泌的重要途径。RNA-seq分析和RT-qPCR数据强调，CNPs暴露诱导的斑马鱼胚胎毒性可能与甾体生成途径中关键酶的基因突变有关。胆固醇作为类固醇激素的前体分子。 激素产生的限速步骤是将胆固醇转运到线粒体内基质，在那里它转化为孕烯醇酮。转录组测序结果表明，sqlea是胆固醇代谢的关键基因之一。孕烯醇酮进入内质网进行进一步的酶促反应，产生各种类固醇激素。类固醇激素对性器官和行为的组织和发育、免疫功能、生长和应激反应都很重要。细胞色素P450酶具有区域特异性，对于催化甾体生成途径中的甾体原特异性反应至关重要，我们的研究还发现了细胞色素P450酶基因的关键差异，包括cyp1a、cyp51、cyp3a65和ugt2b3。研究表明，cyp11a1在具有卵黄合胞层、染色体间原基、染色体间腺的斑马鱼胚胎中表达。胚胎斑马鱼的芯片分析和原位杂交显示，cyp51在眼脑和尾鳍的额叶表皮细胞中强烈表达，表明cyp51和其他异戊二烯合成酶可能在造血和血管发育中发挥作用。大多数CYP在发育过程中的作用和调节是未知的，阻碍了对发育毒性机制的理解。此外，催乳素受体相关蛋白/17β-羟基类固醇脱氢酶7型基因（hsd17b7）在胚胎发育和胎儿存活中起着关键作用。研究表明，敲除hsd17b7功能可能导致小鼠胚胎死亡、脑畸形和心脏缺陷。此外，胚胎发育中类固醇生物合成的途径尚未阐明。虽然类固醇激素在成年斑马鱼中的作用已经得到了很好的研究，但它们对早期胚胎发育的影响还远未清楚。进一步阐明类固醇和激素生物合成途径在斑马鱼胚胎发育中的毒性机制可能很重要。

总之，我们首次证明了斑马鱼胚胎暴露于CNPs的发育毒性。RNA-Seq分析和RT-qPCR数据表明，CNPs暴露主要影响光转导、氨基酸代谢、类固醇和类固醇激素生物合成途径的DEGs。这些数据可以提供进一步可能的研究方法，以更好地了解 CNP 在胚胎发育中的毒理学机制。

原文出自：The developmental toxicity and transcriptome analyses of zebrafish (Danio rerio) embryos exposed to carbon nanoparticles - ScienceDirect