摘要：斑马鱼具有增殖快、与人类基因同源性高等优点，是研究心血管疾病必不可少的模式生物。斑马鱼胚胎/幼虫是毒理学研究中有价值的实验模型，用于分析药物毒性，包括肝毒性、肾毒性和心脏毒性，以及临床前阶段的药物发现和药物安全筛选。心率 (HR) 可作为心脏毒性研究的功能终点，而心率变异性 (HRV) 可作为心律失常的指标。心脏毒性是药物试验早期和晚期终止的主要原因，因此更全面地了解斑马鱼HR和HRV非常重要。本文介绍了心率和心率变异性在特定领域的应用，重点介绍了斑马鱼心跳检测程序、信号分析技术和成熟的商业软件，如LabVIEW、Rvlpulse和ZebraLab。我们还比较了 HR 检测算法和基于心电图 (ECG) 的心脏信号检测方法。还系统地分析了 HR 和 HRV 之间的关系； HR被证明与HRV呈负相关。本文还重点介绍了药物测试的应用。 此外，HR 和 HRV 被证明受自动神经系统的调节；本文还总结了其与ECG测量的联系。

关键词：斑马鱼心率检测  HR  HRV  ECG  自主神经系统  心血管疾病

简介：斑马鱼作为一种脊椎动物，在毒理学、致畸学、发育生物学和药理学等领域有着广泛的应用。斑马鱼模型的其他应用不断涌现，因为其优势包括胚胎发育快、身体透明以及与人类的高度遗传同源性。斑马鱼心脏是第一个发育的器官，对于研究心脏病和心脏毒性的电生理学非常有用。此外，我们的实验室还证明斑马鱼是研究小分子和肽/蛋白质生物制剂对心脏毒性和心脏保护的药理作用的一个非常强大和方便的模型。心跳和超声心动图（ECG）通常用于量化和临床评估心脏异常； 然而，数据存储和信号处理是图像采集方法的一大挑战。与手动检测和观察相比，自动HR检测显示出极大的优势。心血管疾病（CVD）通常用于指各种疾病，包括高血压、冠心病、外周血管疾病、心力衰竭、风湿性心脏病、先天性疾病和心肌病。根据世界卫生组织的统计，心血管疾病是全球死亡的主要原因，占全球所有死亡人数的 31%，包括心源性猝死。在中国，心血管疾病占所有死亡人数的40%，给医疗服务带来沉重负担。流行病学研究表明，心血管疾病（包括冠心病、心源性猝死、心力衰竭、心房颤动和中风）的风险增加与较高的静息心率（HR）有关。冠状动脉疾病、心肌病、先天性心脏病、心脏瓣膜缺陷和心律失常是心血管疾病死亡和中风的主要原因。可以通过测量各种CVD动物模型的心率和心率变异性（HRV）来评估CVD相关疾病。因此，自动准确的心率检测和心率变异性分析值得更多的关注和深入研究。以前的斑马鱼研究主要集中在心脏再生； 很少有人提到 HR 或 HRV，这就解释了我们为什么进行这项研究，即总结斑马鱼心脏 HR 和 HRV 测量的最新进展。开创性的研究在斑马鱼表型特征评估方面取得了相当大的成功，并且引入了许多软件包和工具集来支持自动图像处理，例如FishInspector，一种自动特征检测图形用户界面。另一个团队使用最先进的技术调查了许多用于斑马鱼图像处理的工具，但很少有免费用于教育和研究目的的工具； 大多数仅可用于商业用途。我们总结了最近的斑马鱼心跳检测和HRV评估工具，以更全面地了解斑马鱼心率检测和心脏电生理信号分析，包括其在药物筛选中的应用。检测斑马鱼心率的现有方法和工具可分为以下几类：1） 心电图（ECG）；2） 半自动检测软件；3） 自动检测图形用户界面；4） LabVIEW软件（结合视频采集设备）；5）人工计数。半自动和自动检测算法是用于短期视频记录的无创技术，似乎适合评估斑马鱼心率。LabVIEW 系列在视频/图像采集方面表现良好，包括 HR 和 HRV 分析，但价格昂贵。人工计数是劳动密集型和繁琐的，并且难以应用于药物发现背景下的高通量筛选。与 HR 相比，涉及 HRV 的斑马鱼心脏研究较少。 HRV 被公认为预测 CVD 风险和其他由异常自动神经系统 (ANS) 调节引起的相关疾病的重要参数。

基于图像的心率分析：斑马鱼心脏信号提取和处理的开创性研究引入了许多方法，包括初级斑马鱼养殖、原始图像和视频数据采集、ROI 定义以及 PCA 和 ICA 的方法。在下面我们首次系统地总结了这些方法。

原始数据采集：实验数据采集主要通过单平台图像/视频采集和高通量筛选批量采集完成。逐拍视频通常在受精后3到4天的斑马鱼幼虫中采集。斑马鱼胚胎是通过成对和分批杂交收集的。在受精后24小时（hpf），用0.003%的PTU处理胚胎以防止色素形成。斑马鱼胚胎通常在E3培养基中保存在28°C以下。由配备数码相机的基本光学显微镜或具有高分辨率记录功能的显微镜获取图像/视频；在以前的研究中，最好使用640×480像素或更高分辨率的自动显微镜每秒15/30帧。

颜色格式：斑马鱼HR数据可以从视频或图像中提取。这些数据有助于定位ROI，例如心脏或流动的血管。LAB颜色空间是用于信号分析的颜色空间之一，通过分离内部亮度通道来工作。其他颜色格式包括RGB、CMYK和灰度。对于颜色格式化，不同的检测方法关注不同颜色通道中像素强度的变化。这些变化发生在一个视频的连续帧之间，有助于定义ROI。比较来自同一视频的所有图像。结果表明，LAB颜色格式有利于识别不同的区域。大多数以前的选择方法将图像或视频颜色转换为灰度格式，即具有阈值设置的二值图像。灰度是用于信号处理的最常用的图像处理方法。

ROI检测：ROI是指图像中包含最重要特征或变化最多的区域； 这可能是斑马鱼的大脑、尾巴或心脏区域。在斑马鱼心跳检测过程中，心房和心室的跳动会改变连续视频帧中的亮度或暗强度，可以用圆圈或其他形状来划分，从而生成ROI。以前的研究手动绘制ROI，而后来的研究则侧重于随着时间的推移自动生成ROI。他们开发了一种算法来根据预定义的 ROI 定义更具适应性的 ROI，以实现可靠的斑马鱼 HR 估计和检测。识别像素强度变化是定义ROI最有用的策略。另一个研究小组发现斑马鱼体内的红细胞、色素和碎片的变化会在视频中产生像素强度的变化，有助于确定ROI。使用亮度强度变化来识别漂移的心脏区域，并计算选定区域的总亮度。通过在选定区域生成遮罩来处理像素强度。已经开发了一个程序来检测斑马鱼的心脏运动，包括收缩和舒张间期、心率和心律失常；总之，证据表明基于像素强度的策略对于识别斑马鱼心脏区域和提取所需信号是有效的。

信号提取：定义合适的 ROI 后，下一步是提取信号。 Pylatiuk 描述了基于计算视频中连续帧之间的 ROI 标准偏差的心跳检测，并将时间序列数据与提取的心跳信号相结合。 然后导出以时间[s]为横轴，像素强度变化为纵轴的图表。相邻的两个心跳信号最大峰值代表心跳间隔。Krishna首次利用多通道ICA分析斑马鱼HR。此外，PCA 用于从 R、G 和 B 通道中提取信息，提取的最大方差代表斑马鱼心脏活动。ICA算法有助于使用单个通道从未知分量的线性混合中估计信号。2018年，该团队提出了一种新的基于强度的方法，结合像素强度变化和时间序列数据来生成功率谱密度（PSD），其峰值对HR有贡献。

信号分析：信号分析是在图像处理过程中获得斑马鱼 HR 的关键。Pylatiuk利用LabVIEW和MATLAB设计了一个用户友好的图形界面，让研究人员能够获得自己的斑马鱼原始数据。当与视频中的时间序列数据相结合时，PSD 是一种提取重要信息的有效策略。 信号密度在纵轴上，时间在横轴上。根据PSD数据中的局部最大值（峰值）计算心跳。采用FFT获取ICA的三通道功率谱。每个通道中最高的 PSD 记录在每一帧中，这有助于揭示 HR 的模式。斑马鱼心率检测过程已逐渐标准化。许多研究基于像素强度变化和亮度变化，使用不同的颜色格式来帮助定义ROI。在信号提取和分析方面，通过PCA和ICA逐步从ROI中提取最重要的信息。PSD和FFT是将信息转换为易于操作的格式的主要方法。进一步处理斑马鱼的心脏信号以检测心率。另一个新兴趋势是第三方商业化软件包的发展。 使用这些软件包的图形用户界面 (GUI) 实现了令人难以置信的省力优势。最常用的软件包是 ViewPoint 公司的 LabVIEW和 MicroZebraLab，专门从事斑马鱼心脏病学和生理学分析。 这些软件包有助于检测心跳和血流。使用商业软件 DanioScope™ 可以在几分钟内完成从视频录制到 HR 提取的整个过程。斑马鱼心率是反映心脏对环境反应的一个重要参数，促进临床试验前心脏病药物筛选。这些最先进的技术在过去的二十年里都取得了长足的进步。斑马鱼 HR 检测对于药物筛选和临床前研究很重要。 斑马鱼和人类的心脏病表现出高度相似性。斑马鱼的心律失常，包括心动过速和窦性心动过缓。镇静剂、麻醉剂和心脏毒性药物，如MS-222、PTU、可卡因、吗啉、普萘洛尔、特非那定和异丙肾上腺素，是实验室测试最广泛的药物。例如，MS-222可以降低斑马鱼的心率，从而导致心动过缓。此前的一项研究调查了可卡因及其与其他药物联合治疗对斑马鱼心脏的影响。可卡因单独导致心律失常，高剂量导致心动过缓。

ECG：ECG 是一种广泛使用的技术，用于记录和分析心脏动作电位 (AP) 和电生理信号。根据先前的研究，这些信号有助于计算人类和成年斑马鱼的 HR 和 HRV。 根据心电图分析，斑马鱼对化学物质和药物的心脏生理反应与人类相似，从而产生相似的信号特征，包括心脏去极化、复极化和传导。有证据表明，斑马鱼心脏的电生理行为与人类心脏非常相似。降低人类 HR 心室 AP 的药物，如利多卡因、尼群地平和硝苯地平，以及延长 AP 的药物，如特非那定，对斑马鱼心室有类似的影响。大多数研究创建和应用图形用户界面（GUI）以清楚地显示 HR 和 HRV 的心电图分析结果。 P波、QRS波群、T波、PR间期、RR间期和QT间期等参数可以通过GUI显示，便于计算HRV。作为常见的参考指标，QT间期与长QT综合征（LQT）和QTc直接相关。LQT 的特点是 HR 相关的 QT 间期延长和 T 波异常。 它反映心脏电生理障碍，是室性心动过速的危险因素，甚至可导致猝死。有证据表明，心电图是量化斑马鱼 HR 和分析 HRV 的有用技术，可提供有关电生理动力学的信息。为了获取斑马鱼的ECG数据，通常将针电极传感器或可穿戴设备插入心脏区域，包括心房和心室。这些传感器通过 ECG 获取数据以进行进一步处理。 传感器通常连接到信号放大器以增强信号。此外，可以从这些处理信号中获得P波、T波、QRS间期、RR间期和QT间期之间的时间延迟。 HR 和 HRV 分析受益于这些信号。在信号处理过程中，使用LabVIEW和MATLAB等商用软件对信号进行采集、显示和分析。设计了一种新的传感器微电极阵列（MEA）膜，并将其放置在斑马鱼心脏的尾部，以将信号传送到LabVIEW GUI进行进一步处理。这允许实时监测和处理斑马鱼HR和HRV。一项研究将该技术应用于药物测试，即研究 MS-222 对清醒斑马鱼的影响。在无创数据采集方面取得了显著的进步。传感器旨在记录心电图活动并监测斑马鱼心脏活动。此外，切除成年斑马鱼的心室，通过观察心电图中的心室去极化和复极，研究心脏再生和斑马鱼心律的变化。HR和HRV对于评估斑马鱼的心脏功能至关重要。心电图也存在局限性；斑马鱼的小尺寸和侵入性切口可能导致心室破裂，这对HR和HRV分析的准确性有重大影响。总体而言，ECG是检测斑马鱼心率和分析心率变异性的重要技术；它对药物引起的变化高度敏感。

斑马鱼心率检测研究进展：心率是心脏活动的重要指标。斑马鱼HR已被广泛用作药物毒性的指标。先前的研究产生了各种HR测量方法，包括初始手动计数、半自动检测算法和自动算法。还开发了第三方软件来评估斑马鱼的HR。最近，在自动批量筛选和处理方面取得了良好进展，提高了 HR 量化效率。Viewpoint是一家提供行为分析工具的成熟技术公司，专注于斑马鱼胚胎和仔鱼的研究，开发了一些软件包，如Microzebralab和Zebralab，以直接或间接检测HR。此外，台湾公司RasVector Technology Inc.开发了RvVisualPulse软件，通过视频记录快速测量心跳。在实际实验中，测量不是独立的，可以结合多种技术来全面了解斑马鱼心率。LabVIEW在这方面发挥着重要作用，是一个允许信号处理和提供可视化界面的平台。LabVIEW常用来分析心电图数据，使HR检测更加方便。ECG 技术以及商业软件和工具包的组合经常用于量化成年斑马鱼心脏的活动。

HRV：在过去的三十年里，斑马鱼 HR 检测方法在速度、便利性和准确性方面取得了长足的进步。 HRV是指心跳之间时间间隔的变化，以及心跳规律性，而HR代表每分钟的心跳次数（bpm）。HRV被定义为节律指数。HRV是心肌梗死、心律失常、心律失常、心房颤动和慢性心力衰竭等心脏功能障碍的重要指标。HRV经常用于评估药物的有效性。一些研究表明，较低的HRV预示着较高的心血管发病率和死亡率，表明HRV的生理重要性。在药物的动物实验中，心率变异性检测越来越受到重视。RR间期代表两个连续R波之间的时间。 因此，HRV 反映了 RR 间期的变化。心率变异性是心脏异常的重要临床指标。对于ECG 数据的 HRV 分析，基于 MATLAB 的软件是有效的。 已开发出微调分析软件，可自动处理、分类、分析和显示心电图信号。有几种工具用于HRV分析，包括LabVIEW、aHRV、Kubios HRV、HRV工具包、Kaplan软件、gHRV和PhysioZoo；所有这些应用程序都有GUI，易于操作。

HR 和HRV关系：众所周知，HR与HRV呈负相关； 较低的 HR 对应较高的 HRV，而 HRV 可以从 HR 中计算出来。 HR 还影响 HRV 作为心血管因素的预测能力。1996 年，欧洲心脏病学会工作组使用 HRV 来描述瞬时 HR 和 RR 间期。首次在清醒成年大鼠和人中系统分析了HRV和HR之间的关系。报告称较低的 HR 会导致较高的 HRV，并且 HR 不能作为自主神经活动的可靠标志，因为它可能因生物体而异。多项研究通过线性/非线性回归分析表明 HRV 与 HR 呈负相关。

结论：斑马鱼 HR 检测与 HRV 相结合可以深入了解心血管风险。 在本次调查中，我们总结了 HRV、ANS、PNS 和 SNS 之间的联系，以及 HR 和 HRV 之间的关系。我们希望斑马鱼将成为CVD领域更易获得的药物筛选生物体， HR和HRV分析可用于临床前研究。许多常用于斑马鱼HR检测和HRV分析的工具也可用于其他动物物种的广泛生理分析。

原文出自：Quantitative measurements of zebrafish heartrate and heart rate variability: A survey between 1990–2020 - ScienceDirect