简介：噻氯匹定通过ADP（二磷酸腺苷）、血小板释放反应和解聚作用抑制血小板聚集。临床上常用于预防心、脑血管等血栓栓塞性疾病。 然而，也有报道称噻氯匹定对心脏有致畸作用，但其具体分子机制仍不清楚。本研究以斑马鱼胚胎为模型生物，研究噻氯匹定的毒性效应。暴露于6、7.5和9 mg/L噻氯匹定溶液中的斑马鱼胚胎表现出几种异常，包括身体弯曲、眼睛变小、卵黄囊吸收变慢、心包水肿、心率变慢、死亡率增加、静脉窦-动脉球（SV-BA）距离变长以及氧化应激增加，这表明发育和心脏毒性。观察到与心脏发育相关的关键基因表达异常，凋亡基因表达水平上调。 进一步的实验揭示了噻氯匹定暴露后，胚胎氧化应激水平上调，导致心肌细胞增殖减少。相反，芳香烃受体 (AHR) 抑制剂 CH223191 保护胚胎免受噻氯匹定的心脏毒性作用，进一步证实了上调氧化应激作为噻氯匹定诱导斑马鱼心脏毒性分子机制的作用。总之，噻氯匹定暴露会导致斑马鱼胚胎的发育和心脏毒性。 因此，需要进一步研究以确定噻氯匹定对人体的潜在危害，这对于指导临床实践安全用药至关重要。

关键词：噻氯匹定  心脏毒性  氧化应激  心脏衰竭  芳香烃受体抑制剂

简介：鉴于全球人口老龄化以及超重和肥胖的负担日益加重，糖尿病的患病率持续上升，导致糖尿病相关大血管并发症（包括冠心病、脑梗死、动脉硬化闭塞症和血栓）的发病率和死亡率居高不下。众所周知，高血糖导致氧化应激和炎症增加，而慢性炎症、内皮功能障碍和高凝状态之间的相互作用促进了糖尿病患者血管并发症的发展。因此，严格控制血糖水平并早期预防和治疗糖尿病相关的大血管并发症对于改善疾病的预后是不可或缺的。噻氯匹定是噻吩吡啶的衍生物，可通过多种诱导剂抑制血小板聚集，如二磷酸腺苷（ADP）（包括外源性和内源性ADP）、胶原、凝血酶、花生四烯酸和前列腺素中的过氧化物。常用于冠心病、脑梗死、血栓、闭塞性动脉硬化、动脉闭塞症等患者。然而，最近的研究报道噻氯匹定具有免疫毒性和细胞毒性，在粒细胞中比在淋巴细胞中更明显。此外，噻氯匹定可能导致秀丽隐杆线虫咽部发育异常和身体变形。其他研究也证明了噻氯匹定对非洲爪蟾的肝脏和心脏的发育毒性和致畸作用，但具体的分子机制仍不清楚。近年来，斑马鱼是研究人类心血管疾病的优秀模型。鉴于CRISPR/Cas9基因组编辑技术正在迅速发展，斑马鱼作为基因编辑模式生物的报告正在增加。斑马鱼基因组全测序，现已公开，成为继人类和小鼠之后的第三个高质量基因组。斑马鱼和人类在基因和器官上有高度的同源性。斑马鱼胚胎具有光学透明、体积小、生长快、产卵期短等优点，已广泛应用于药物筛选。它也被广泛用于检测环境毒性和药物毒性。斑马鱼和人类心脏生理学有很大的相似之处，包括基本的收缩动力学和动作电位形态。此外，小胚胎通过被动扩散获得足够的氧气，持续发育数天，这并不完全取决于心血管系统的功能。 斑马鱼胚胎的这一特殊特征允许进一步研究患有严重心血管缺陷的动物。此外，斑马鱼心脏由一个心房和一个心室组成，在许多调节心脏形成的遗传程序中与人类心脏一样保守。斑马鱼心脏是第一个形成的器官，在胚胎发育中起主要作用，早期心脏发育标志基因包括 myh6 、 vmhc 、 gata4 、 nkx2.5 、 tbx5 和 tbx2b。氧化应激与多种疾病的发生和衰老密切相关。ROS是氧化应激的代谢产物，在胚胎发育中起重要作用。过量的ROS可能会导致细胞内线粒体活性失衡，导致脂质、蛋白质和核酸氧化，破坏其生物学功能。研究表明，芳香烃受体 (AHR) 介导有机物诱导的氧化应激，导致 DNA 损伤和细胞凋亡，从而导致心脏发育毒性。 相反，AHR 抑制剂 CH223191 可以显著减少斑马鱼胚胎药物引起的心脏畸形。本研究以斑马鱼为模型生物，研究噻氯匹定的发育毒性和心脏毒性效应，包括心率、死亡率、心脏结构变化、氧化应激、心脏发育关键基因和凋亡相关标记物的变化。我们的研究揭示了噻氯匹定对斑马鱼早期心脏和胚胎发育的毒性，为临床用药提供了有价值的指导。

噻氯匹定引起的发育毒性：与对照组相比，在用不同浓度（6、7.5、9 mg/L）的噻氯匹定处理的72 hpf 时斑马鱼胚胎中观察到心包水肿，在整体和个体斑马鱼胚胎中均发现具浓度依赖性的。噻氯匹定处理的胚胎有明显的尾部弯曲和卵黄囊吸收。噻氯匹定溶液治疗后眼较对照组小。与对照组相比，噻氯匹定溶液处理组的卵黄面积较大，因为卵黄吸收较慢。

图 1、 暴露于不同浓度噻氯匹定的斑马鱼胚胎表型特征。噻氯匹定处理胚胎的死亡率也以浓度依赖性方式增加， 用 20mg/L 噻氯匹定处理48、72 和 96 hpf的胚胎观察到 100% 的死亡率。在24、48、72和96hpf时，噻氯匹定的LC50为22.68 mg/l，14.71  mg/l，10.30 mg/L和9.214 mg/L。

噻氯匹定引起的心脏毒性: 暴露于噻氯匹定后，心房和心室之间的间距逐渐拉长，在荧光显微镜下呈线性化趋势。随着噻氯匹定溶液浓度的增加，心率逐渐降低，观察到静脉窦与动脉球之间的距离明显长于对照组。如激光共聚焦显微镜所示随着噻氯匹定浓度的增加房室瓣之间的距离变宽，而绿色荧光显示心脏较弱且有缺陷，表明心肌细胞受损。

图2、暴露于噻氯匹定的斑马鱼胚胎的心脏表型特征。

图3、噻氯匹定暴露引起的氧化应激。

图 4. 噻氯匹定暴露后心脏和基因表达水平的共焦代表性图像。

噻氯匹定引起氧化应激增加：绿色荧光位点代表活性氧的积累位点。与对照组相比，治疗组的绿色荧光强度明显更高，而绿色荧光面积也更大，集中在头部、心脏、肝脏、卵黄和肠道。同时，与氧化应激相关的酶活性增强。噻氯匹定降低了CAT和SOD的活性，表明胚胎的抗氧化能力降低。MDA含量上调，表明氧化应激导致细胞膜损伤。这些发现表明，氧化应激相关损伤是噻氯匹定处理的胚胎心脏毒性机制之一。

噻氯匹定诱导斑马鱼胚胎细胞心脏基因异常表达和凋亡，抑制心肌细胞增殖：与对照组相比，噻氯匹定处理的斑马鱼胚胎中 myh6、vmhc、gata4、nkx2.5、tbx5 和 tbx2b 的表达水平失调，这与心脏发育有关。凋亡相关基因bax、caspase 3、p53和bax/bcl2的水平显著上调，且与噻氯匹定浓度呈剂量依赖关系。AO染色结果显示，与对照组相比，TIC处理组斑马鱼胚胎的头部、眼睛和心包有明显的凋亡。TUNEL染色显示对照组和TIC治疗组心肌细胞凋亡不明显。阳性对照组细胞凋亡明显。PCNA增殖染色结果显示，对照组心肌细胞增殖，TIC组心肌细胞未见明显增殖。这些结果表明，噻氯匹定可诱导斑马鱼胚胎细胞凋亡，心脏毒性可能与细胞凋亡无关，但主要影响心肌细胞的增殖。

CH223191减轻噻氯匹定引起的心脏毒性：与7.5 mg/L噻氯匹定治疗组相比，7.5 mg/L噻氯匹定 + 0.25 μM CH223191恢复组部分表现出正常的心脏形态和心率。此外，动脉窦球间距的延长也较少。共聚焦显微镜检查发现，7.5 mg/L噻氯匹定 + 0.25 μM CH223191恢复组与7.5 mg/L噻氯匹定治疗组相比，房室瓣间距变窄，绿色荧光增强，心脏位置正常。这些发现表明 CH223191 适度地对抗噻氯匹定诱导的心脏毒性作用。

图5、CH223191逆转噻氯匹定引起的心脏毒性。

图 6. CH223191 减轻噻氯匹定暴露引起的氧化应激。

CH223191下调噻氯匹定诱导的氧化应激：为了进一步证实在斑马鱼胚胎中观察到的心脏毒性可能是由噻氯匹定诱导的氧化应激引起的，在72 hpf收集对照组、7.5 mg/L噻氯匹定治疗组、7.5 mg/L噻氯匹定 + 0.25 μM CH223191恢复组的斑马鱼胚胎。 . 用 AHR 抑制剂 CH223191 拯救了斑马鱼胚胎。 胚胎被 ROS 染色。与7.5 mg/L噻氯匹定组相比，噻氯匹定 + 0.25 μM CH223191组心脏及其他部位ROS表达显著降低，且与对照组相比，CH223191组CAT、SOD活性和MDA含量恢复。进一步表明，噻氯匹定诱导的心脏毒性作用与氧化应激机制密切相关，CH223191可对抗氧化应激机制。与7.5 mg/L噻氯匹定相比，7.5 mg/L噻氯匹定+ 0.25 μM CH223191挽救组心脏发育相关基因myh6、vmhc、gata4、nkx2.5、tbx5和tbx2b的表达水平有所恢复。此外，挽救组凋亡相关基因bax、caspase3、p53的水平以及bax/bcl2的比值也有所恢复。AO染色显示7.5 mg/L噻氯匹定组头部、眼部和心包细胞凋亡，而7.5 mg/L + 0.25 μM CH223191组细胞凋亡减少。PCNA增殖染色显示7.5 mg/L + 0.25 μM CH223191挽救组心肌细胞增殖明显高于7.5 mg/L噻氯匹定组。 这些结果表明 CH223191 通过促进心肌细胞增殖来挽救噻氯匹定诱导的心脏毒性。

讨论：氧化应激是指活性氧的产生和抗氧化作用之间的不平衡。 在环境、疾病等有害因素的刺激下，由于ROS过度积累、中性粒细胞炎症浸润、蛋白酶分泌增加、大量氧化中间体的产生，导致损伤。研究表明，活性氧升高影响心肌细胞分化中关键基因的表达，导致斑马鱼胚胎心脏发育缺陷。此外，氧化应激与疾病和衰老密切相关。生物体内有两种主要的抗氧化系统，即非酶系统和酶系统。 非酶系统直接淬灭 ROS，而酶系统由解毒 ROS 的特定酶组成。观察到 CAT、MDA 和 SOD 的酶活性在调节氧化应激中起着至关重要的作用。MDA作为氧自由基在氧化变性过程中的产物，被认为是脂质过氧化的指标。SOD是一种抗氧化金属酶，通过催化超氧阴离子自由基歧化生成氧气和过氧化氢，在平衡氧化和抗氧化方面发挥重要作用。另一方面，CAT催化过氧化氢分解成氧气和水，是过氧化物酶体的标志酶。在食品工业中，CAT用于食品包装，以防止食品氧化。我们的研究结果显示，与对照组相比，噻氯匹定治疗组的绿色荧光分布明显更亮、更大，表明噻氯匹定治疗后可诱导ROS的积累。此外，与对照组相比，噻氯匹定治疗组的CAT和SOD活性显著下调，而MDA含量上调，表明噻氯匹定暴露可导致氧化应激失衡，ROS的过度积累导致CAT和SOD活性降低，MDA含量升高，导致斑马鱼胚胎心脏毒性。为了探索噻氯匹定引起心脏毒性的分子机制，我们检测了心脏发育早期的几个关键基因。myh6、vmhc、gata4、nkx2.5、tbx5 和 tbx2b 等转录因子在心脏发育中是不可或缺的。 Myh6 在心脏中高度表达，编码心脏 α-肌球蛋白重链。 研究表明myh6突变与心肌病和房间隔缺损有关。gata4 的异常表达已被证明会导致心脏畸形和先天性心脏病 (CHD)。Vmhc也是心脏的标记基因，Vmhc的表达先于myh6，tbx5和gata4的表达紊乱可能导致心脏间隔瓣缺损。Nkx2.5 是心肌细胞分化的关键，并维持特定的心室表型。斑马鱼心肌中tbx2b的异常水平可能导致发育性心脏缺陷。我们的研究结果表明，接触噻氯匹定溶液会导致心脏发育关键基因水平的失调。Tbx5基因被明显抑制，但其他与心脏发育相关的基因被激活。这些基因的异常表达可能导致心脏间隔瓣缺损和心脏畸形。 因此，我们推测噻氯匹定引起的发育异常和心脏毒性可能是由于ROS过度积累导致心脏基因表达失调引起的。我们还研究了噻氯匹定对斑马鱼胚胎心脏细胞增殖和凋亡的影响。 众所周知，ROS的积累会影响p53的稳定表达。P53通过抑制抗凋亡基因bcl2和诱导促凋亡基因Bax调控细胞周期和凋亡。QPCR结果显示，噻氯匹定溶液暴露组细胞凋亡诱导基因显著上调，提示噻氯匹定可诱导细胞凋亡。AO染色和TUNEL染色提示，与对照组相比，噻氯匹定溶液暴露组未引起心肌细胞凋亡增加，而是诱导头部、眼部、心包等部位细胞凋亡。结果表明，噻氯匹定引起的心脏毒性可能是由于ROS过度积累导致心脏基因表达失调和心肌细胞增殖减少所致。

结论：噻氯匹定诱导的斑马鱼胚胎心脏发育毒性归因于AHR介导的氧化应激。氧化应激导致活性氧的积累，抑制心肌细胞增殖，并干扰心脏发育相关基因的表达。需要进一步研究以确定噻氯匹定对人体的潜在危害，这为临床安全用药提供了必要的证据。

原文出自：Ticlopidine induces cardiotoxicity in zebrafish embryos through AHR-mediated oxidative stress signaling pathway - ScienceDirect