改写教科书：利用基因修饰小鼠发现第四层脑膜SLYM！

脑膜是覆盖大脑和脊髓的膜状结缔组织的分层单元。这些覆盖物包住中枢神经系统结构，以便它们不直接接触脊柱或头骨的骨骼。传统三层脑膜理论认为：中枢神经系统由硬脑膜、蛛网膜和软脑膜分隔。

之前学者们认为，蛛网膜与软脑膜之间存在一个称为“蛛网膜下腔”的较大空间。今年Maiken Nedergaard研究团队颠覆性地发现了在蛛网膜下腔中存在一种特殊的淋巴样膜，形成了大脑的第四层脑膜结构，被称为蛛网膜下腔淋巴样膜（Spider-Like Lymphatic Membrane，SLYM），它在物质交换和免疫监视方面发挥着关键作用。这一发现重新定义了大脑脑膜系统，其研究成果发表于Science科学杂志[1]。

Maiken Nedergaard团队主要利用了Prox1-EGFP+报告小鼠（即Prox1表达处同时表达增强型绿色荧光蛋白）进行相关实验，探索了大脑周围的SLYM内脑脊液和免疫细胞运输的组织方式。

研究人员通过体内双光子显微镜观察Prox1-EGFP+小鼠体感皮层，发现在胶原束下方存在一层扁平的Prox1-EGFP+单层细胞，与松散的胶原纤维混合在一起，形成了SLYM。进一步的分析表明，SLYM的厚度约为14.2微米，覆盖着蛛网膜下腔的血管，而硬脑膜的平均厚度为21.8微米，被胶原纤维包围。这表示，二者在结构上有明显的差别。

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图1 活体成像显示第四脑膜层

此外，全脑结构分析显示，SLYM与静脉窦内皮细胞直接相连，为静脉窦壁上的蛛网膜下腔绒毛样结构。在人类皮层组织中也发现了SLYM存在于整个蛛网膜下腔。

为确定SLYM是否构成一种不渗透的膜，研究者们通过在Prox1-EGFP+小鼠SLYM两侧注射红色荧光微球和蓝色荧光微球，发现这些荧光团并没有相互渗透。而渗透性实验显示SLYM不允许3kDa及以上分子通过，这表明，SLYM是一种屏障，将蛛网膜下腔分成上浅表层和下深层两个腔室，限制了大多数肽和蛋白质（如β-淀粉样蛋白和tau）在上下蛛网膜下腔间的交换。

图2 SLYM代表将蛛网膜下腔空间细分为两个隔室的屏障.png

图2 SLYM代表将蛛网膜下腔空间细分为两个隔室的屏障

免疫组织化学染色实验表明，SLYM中的Prox1-EGFP+细胞也表达了其他淋巴标记物PDPN和细胞维A酸结合蛋白2（CRABP2），表明SLYM与淋巴系统有关。进一步的免疫荧光结果显示，SLYM不表达蛛网膜屏障细胞层的主要成分CLDN-11，也不表达蛛网膜小梁的标志物淋巴管内皮受体1（LYVE1）。这些结果表明，SLYM是单层组织膜结构而不是管状结构，并且它表现出一组独特的淋巴标记。

研究人员还通过双光子显微镜观察到SLYM中存在大量的白细胞，而在腹腔注射脂多糖后，SLYM中的白细胞聚集明显增加，这种异常聚集也在老年小鼠中观察到。此外，SLYM中还存在巨噬细胞和树突状细胞，表明SLYM是一个关键的免疫细胞微环境。

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图3 SLYM拥有大量髓系细胞

这项研究的重大发现表明，在小鼠和人类大脑中，都存在着第四层脑膜——SLYM。它包裹着血管并与静脉窦内皮紧密相连，允许脑脊液和静脉血进行物质交换；与此同时，SLYM也是免疫发挥作用过程中的重要角色，为我们了解大脑的免疫功能和液体运输功能提供了崭新的视角。

在该研究中，Maiken Nedergaard团队利用Prospero相关同源异形盒蛋白1（Prox1）作为标记淋巴管内皮细胞标志物，其灵感或许来源于该团队在2012年发现的胶质淋巴通路，以及2015年脑膜淋巴管的发现。

Prox1是一种高度保守的、决定淋巴命运的转录调节因子，有助于淋巴管的形成。它在中枢神经系统、晶状体、视网膜、肝脏、胰腺和心脏等器官的发育中发挥关键作用，并且被认为是淋巴系统的主调节分子。

此外，随着越来越多的证据表明Prox1也与多种癌症的发生有关。Prox1可通过miR-9使E-钙粘素下调来促结肠癌发展；在肝细胞癌病例中，它是一种抑癌基因，能抑制促转移转录因子TWIST1的转录。Prox1表现出重要的肿瘤抑制和肿瘤增强特性，这取决于肿瘤的起源器官[2]。

随着研究的发展，或许从前许多关于大脑的固有认知都将被改写。

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Prox1-IRES-CreERT2与报告基因小鼠杂交获得Prox1-CreERT2/+;Rosa26-tdTomato/+小鼠，经tamoxifen处理后，在海马齿状回部位实现特异性表达。

Fig1. CreERT2-mediated recombination in Dentate Gyrus of Prox1-CreERT2/+;Rosa26-tdTomato/+ mouse.

也能在眼、心脏、肾脏、胰腺、脾脏、等多种器官中实现PROX1的时间特异性表达。

Fig2. Detection of tdTomato(red) in various tissues of Prox1-CreERT2/+;Rosa26-tdTomato/+ mice. Labeling was also observed in pituitary gland, retina, heart, thymus, stomach, lung, submandibular gland, muscle, ovary, spleen, pancreas and kidney.

参考文献

[1] Møllgård K, Beinlich FRM, Kusk P, Miyakoshi LM, Delle C, Plá V, Hauglund NL, Esmail T, Rasmussen MK, Gomolka RS, Mori Y, Nedergaard M. A mesothelium divides the subarachnoid space into functional compartments. Science. 2023 Jan 6;379(6627):84-88. doi: 10.1126/science.adc8810.

[2] Ntikoudi E, Pergaris A, Kykalos S, Politi E, Theocharis S. The Role of PROX1 in Neoplasia: A Key Player Often Overlooked. Diagnostics (Basel). 2022 Jul 4;12(7):1624. doi: 10.3390/diagnostics12071624.

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