前言

在生物医学研究中，精准定位想要研究的目的基因或细胞是至关重要的。为了实现这一目标，报告基因工具鼠成为了不可或缺的研究工具。然而，面对种类如此繁多的报告基因工具鼠，“科研汪”们早已眼花缭乱，选择困难症都犯了...别怕，小编今天就来为您答疑解惑啦！希望能帮您找到合适的“小帮手”，顺利开启科研之路！

什么是报告基因工具鼠？

报告基因工具鼠，顾名思义就是携带报告基因（reporter gene）的小鼠模型，它是利用基因工程技术手段，将报告基因整合到小鼠的基因组中构建而成。当报告基因表达时，我们可以借助实验仪器观察到其在组织或细胞水平的表达情况，从而实现在体内进行基因表达监测、细胞标记和谱系示踪等研究。

报告基因工具鼠在许多研究领域中得到了广泛的应用。在发育生物学研究中，研究人员可以利用报告基因工具鼠来观察特定基因在胚胎发育过程中的表达模式，从而揭示胚胎发育的机制。在神经科学领域，报告基因工具鼠可以帮助科学家研究神经元的发育和连接，揭示大脑功能和神经系统疾病的机制。在免疫学研究中，报告基因工具鼠可以用来研究免疫细胞的分化和活化过程，探索免疫应答的调控机制。

图1. 报告基因工具鼠的部分应用场景[1]

体内研究常用的报告基因有哪些？

报告基因是那些能编码某种易于检测蛋白质或酶的基因，通过它的表达产物便捷、可靠、灵敏的来标定目的基因的表达调控。体内研究常用的报告基因包括β-半乳糖苷酶、荧光蛋白、荧光素酶等。

β-半乳糖苷酶

β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-gal）由大肠埃希菌LacZ基因编码，是一种由四个四聚体组成的酶，每个四聚体的分子量为465kDa，可将无色化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色物质：5-溴-4-靛蓝。β-ga1常用于整体胚胎或组织切片的基因表达研究，因为利用β-gal进行胚胎的全身染色，可以充分了解某一基因在体内的表达谱全貌。

图2. 利用lacZ检测Lgr5基因的表达情况[6]

荧光蛋白

荧光蛋白家族（fluorescent protein family）是从水螅虫纲和珊瑚类动物中发现的相对分子质量为(2～3)×104的同源蛋白，包括绿色、红色、黄色和青色荧光蛋白等，其中绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是应用最多的荧光蛋白。

荧光蛋白的发光原理在于其发色基团经一定波长的光（激发光）照射后被激活，并将能量以光能形式释放，这时我们就能在荧光显微镜下看到日思夜想的荧光色啦！荧光蛋白常用于研究目的基因表达，蛋白质运输以及各种细胞内动态的生物化学信号通路等。

图3. 利用荧光蛋白研究心脏发育或再生机制[7]

荧光素酶

荧光素酶（luciferase）是生物体内催化不同底物(如荧光素、腔肠素等)发射出荧光或催化脂肪醛氧化发光的一类酶的总称，其中最具代表性的是萤火虫荧光素酶（firefly luciferase，Fluc）和海肾荧光素酶（renilla luciferase，Rluc）。

萤光素酶可以催化自身底物氧化，在氧化过程中，一部分能量以光子形式被释放，从而发出生物荧光。只有活细胞内才会产生发光现象，且光的强度与标记细胞的数目成正比。因此，荧光素酶自发光的活体成像技术已被广泛应用于生命科学、医学研究及药物开发等领域。

图4. 活体成像示踪Il1a细胞因子的表达。

不同类型报告基因具有各自的优缺点（见表1）。在实际运用中，须结合研究的目的、信号检测的时间性与空间性、首选的检测方法、组织与细胞的类别等选择适合的报告基因系统。

如何将报告基因整合到小鼠基因组中？

图5. PB转座子系统

图6. 条件性表达报告基因小鼠的构建示意图[8]

2.基因敲入

与转基因不同，基因敲入是在小鼠内源基因的特定位点插入报告基因，可以更好地研究该基因的功能和调控机制。想要将外源报告基因敲入小鼠的内源基因，有以下三种方式：

图7. 基因敲入方式构建报告基因工具鼠策略图。

想必大家在选用共表达时，还会纠结IRES和2A元件要怎么选择？往期小编已经为大家详细讲解过如何选择连接元件（详见往期推文：连接元件丨2A和IRES怎么去选择？）。基于往期推文，小编对IRES和2A元件的优缺点进行了简要总结，供大家参考~

优点：IRES上下游的两个蛋白可以同时表达，并且翻译出的两个蛋白是完全独立的。

缺点：IRES的序列较长（约600bp），其应用常受到载体容量的限制。此外，IRES前后两个蛋白无法实现等量表达。通常情况下，下游蛋白的表达量仅为上游蛋白的10%~50%。

优点：2A肽长度小且剪切效率极高，能够实现多蛋白的等量表达。

缺点：上游蛋白会多出20余个氨基酸的多肽尾巴，下游蛋白会在N端多出一个脯氨酸。这种额外增加的2A肽结构可能会对目的蛋白的功能造成一定的影响。

图8. 连接元件IRES和2A的作用原理[9]

由于IRES和2A肽都有着各自的优缺点，建议参考目的蛋白的相关文献报道，或依照经验进行构建。

Reference：

[1] Kasatkina LA, Verkhusha VV. Transgenic mice encoding modern imaging probes: Properties and applications. Cell Rep. 2022;39(8):110845. doi:10.1016/j.celrep.2022.110845

[2] Li S, Chen LX, Peng XH, et al. Overview of the reporter genes and reporter mouse models. Animal Model Exp Med. 2018;1(1):29-35. Published 2018 Apr 19. doi:10.1002/ame2.12008

[3] Abe T, Fujimori T. Reporter mouse lines for fluorescence imaging. Dev Growth Differ. 2013;55(4):390-405. doi:10.1111/dgd.12062

[4] Spergel DJ, Krüth U, Shimshek DR, Sprengel R, Seeburg PH. Using reporter genes to label selected neuronal populations in transgenic mice for gene promoter, anatomical, and physiological studies. Prog Neurobiol. 2001;63(6):673-686. doi:10.1016/s0301-0082(00)00038-1

[5] 张禾璇,单可人,官志忠.报告基因研究及其应用进展[J].国际遗传学杂志, 2013, 36(1):7.DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-4386.2013.01.002.

[6] Barker N, van Es JH, Kuipers J, et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 2007;449(7165):1003-1007. doi:10.1038/nature06196

[7] Li Y, Lv Z, He L, et al. Genetic Tracing Identifies Early Segregation of the Cardiomyocyte and Nonmyocyte Lineages. Circ Res. 2019;125(3):343-355. doi:10.1161/CIRCRESAHA.119.315280

[8] Cazemier JL, Clascá F, Tiesinga PH. Connectomic Analysis of Brain Networks: Novel Techniques and Future Directions. Front Neuroanat. 2016;10:110. Published 2016 Nov 9. doi:10.3389/fnana.2016.00110

[9] Gurumurthy CB, Saunders TL, Ohtsuka M. Designing and generating a mouse model: frequently asked questions. J Biomed Res. 2021;35(2):76-90. doi:10.7555/JBR.35.2020019