随着酶联免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用，使体外检测各种细胞因子及抗体研究有了新的突破。在研究免疫应答机制时以往常用酶联免疫吸附法（ELISA）检测体液中游离的细胞因子（CK）或抗体。但由于游离的循环抗体或CK的半衰期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反映体内的抗体及CK的水平。上世纪80年代，国外的科研工作者根据ELISA技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术。

1.培养板的预处理：在24孔培养板内加0.5mL 0.2%戊二醛，37℃，4h，弃掉板中的处理液，用PBS洗涤3次，每次3min；

2.抗原包被：将适量抗原溶于包被缓冲液中，每孔加入0.5mL，4℃过夜，PBS-T洗涤3次，每次3min；

3.制备细胞悬液：将待测已致敏小鼠处死，取出脾脏，置于加有Hanks液的小平皿内，用钝头直角9号注射器针头破少许脾被膜后，感触细胞，用毛细吸管轻轻吹散细胞团后，将悬液通过250目尼龙网，取绿叶，1000r/min离心5min，Hanks液洗涤3次，细胞计数后，用1640液重新悬浮细胞，配成所需浓度；

4.往各孔中加入0.5mL含不同浓度(104-106/mL )的细胞悬液，置37℃，5% CO2条件下孵育2-4h，弃掉培养液，PBS-T洗涤3次，每次3min；

5.往各孔中加入0.5mL生物素化抗体 (Bio-Ab) (2mg/mL)，37℃孵育1h或4℃过夜，弃掉液体，PBS-T洗涤3次，每次3min；

6.加入辣根过氧化物酶结合的亲和素 (Avi-HRP) (2mg/mL)，37℃孵育30min，弃掉液体，PBS-T洗涤3次，每次3min；

7.配制明胶-底物液：在37℃水浴中，将2.5mL TMB溶液 (4mg/mL甲醇溶液) 滴加如7.5mL 10%明胶溶液 (用pH5.0磷酸钠-柠檬酸缓冲液配置) 边加边搅，溶液呈白色，加入14mL 3% H2O2；

8.显示与计数：将培养板底冰浴，每孔加入0.6mL明胶-底物液，约3min，混合液凝固，将培养板取出，置室温5min，将板倒置，用肉眼和低倍放大镜计数所显示出的颜色斑点。