摘要：CRH 神经元释放的促肾上腺皮质激素释放激素 (CRH)能激活下丘脑-垂体-肾上腺 (HPA) 轴，主要的生理应激反应系统之一。 HPA 轴上运行复杂的反馈回路，了解在应激障碍背景下调节 CRH 神经元的神经生物学机制非常重要。我们回顾了斑马鱼体内研究如何提高 CRH 神经元的神经生物学知识。精神分裂症1(DISC1) 突变斑马鱼减弱了应激反应，可用于模拟人类应激障碍。我们认为与精神疾病的机制联系得DISC1影响CRH神经元的发育和功能。

研究CRH轴的斑马鱼模型：促肾上腺皮质激素释放激素 (CRH)，也称为促肾上腺皮质激素释放因子，是一种 41 个氨基酸肽。虽然在身体许多部位的不同组织中产生，但 CRH 研究最多的是它作为一种释放激素参与下丘脑-垂体-肾上腺 (HPA) 轴介导的应激反应。当应激源激活HPA轴时，CRH从投射到正中隆起的下丘脑室旁核（PVN）的小细胞神经元释放；CRH 进入门静脉系统并通过小毛细血管运输到垂体前叶。鱼类HPI 轴激活诱导神经分泌视前区 (NPO) 的神经元分泌 CRH。这些细胞将直接的神经元投射发送到垂体前叶的远端。在垂体前叶的促皮质激素细胞中，CRH 与其受体结合。鱼类和哺乳动物中都存在两种受体，CRH受体1和CRH受体2（分别为CRHR1和CRHR2），CRHR1是鱼类HPI轴的主要受体。受体结合启动促肾上腺皮质激素（ACTH）的合成和释放，促肾上腺皮质素通过循环到达肾上腺或内分泌腺。ACTH 与肾间腺的类固醇生成细胞中的受体 MC2R（黑皮质素 2 受体）结合从而启动皮质醇的合成，皮质醇是鱼类和人类的关键应激激素。

小鼠损伤和遗传学研究表明CRH神经元对应激反应至关重要。然而，哺乳动物下丘脑位于大脑深处，很难进入限制了此类研究。斑马鱼的大脑要小得多，适合进行体内神经生理学实验。斑马鱼为研究支持行为表型的神经发育和神经生理学机制提供了一个遗传易处理的高通量系统。将讨论斑马鱼 CRH 系统，重点关注下丘脑 CRH 神经元。 此外，我们讨论了 CRH 与精神分裂症 1 (DISC1) 的相互作用，动物模型表明 CRH 系统发生了改变。

斑马鱼下丘脑的CRH神经元：斑马鱼 CRH 神经元分布在整个大脑中以相当保守的方式分布。 哺乳动物CRH 由单个基因编码以相当保守的方式分布。 硬骨鱼两个 CRH 基因 crha 和 crhb 通过基因组复制进化。crha和crhb基因分别编码162和132个氨基酸多肽具有44%的同一性和56%的相似性。crhb被认为是哺乳动物CRH基因的同源基因，其研究范围比crha广泛得多，crha的表达仅限于脑室周围下丘脑。crhb首先在受精后24小时左右（hpf）表达，从受精后3天起（dpf）可以在大脑的多个区域检测到，包括丘脑下部、视前区、后结节、下丘脑、腹侧丘脑和后脑以及视网膜。在斑马鱼的NPO中发现视前区crh表达神经元。该区域内表达 crh 的神经元与其他表达催产素 (oxt)、精氨酸加压素 (avp)、脑啡肽原 a (penka)、神经降压素 (nts) 和生长抑素的神经元形成密集的混合簇。而表达胆囊收缩素 (cck)、脑啡肽原 b (penkb) 和血管活性肠肽 (vip) 的神经元则位于不同的 NPO 亚区。 NPO 之外可以在下丘脑的其他区域特别是在结节区域发现表达 crh 的细胞，小鼠也是如此。

鱼类的功能研究支持NPO的CRH神经元在应激调节中的作用：在斑马鱼身上的研究揭示了NPO的CRH神经元在完整动物体内对急性应激暴露的反应。响应性CRH NPO细胞的数量也随着应激强度的增加而增加，并且这些细胞还表现出Ca2+增加。数据表明，CRH细胞活动受到严格调控并根据应激源强度而变化以确保HPA轴反应与威胁严重程度成比例。随后的一项研究利用分子、成像和计算技术研究了各种NPO神经肽在应激行为反应中的作用。与其他一些NPO肽能群体相比表达crh的神经元在对特定威胁的反应方面表现出专业化。例如，许多表达crh的神经元纯粹对热、盐度或酸度做出反应，而不是对多种威胁做出反应。虽然消融 crh 或 oxt 的表达神经元对威胁的行为反应没有影响，但两者的联合消融显着降低了对厌恶刺激的行为反应，这表明这些单独的神经元簇共同作用以促进应激诱导行为。随后的实验表明，表达oxt和crh的NPO簇在很大程度上是谷氨酸能的，除了投射到垂体外，还投射到脑干中一组特定的脊髓投射神经元，这对应激运动反应至关重要。在很短的时间内观察到对厌恶性刺激的行为反应，这表明CRH NPO神经元在对各种应激源的快速运动反应中发挥作用。使用 CRISPR crhr1 敲除 (KO) 斑马鱼在体内研究了 CRH 系统。crhr1 KO 仔鱼无法对急性应激源做出反应，即内源性皮质醇水平在应激暴露后并没有像在野生型中观察到的那样迅速增加。在明暗运动试验中crhr1 KO仔鱼也表现出行为改变，通常在明暗期冻结，在黑暗期自由游泳。在黑暗阶段crhr1 KO 仔鱼在 15 分钟和 60 分钟时间点与野生型相比表现出一些低活性。在光照阶段，应激暴露诱导野生型仔鱼过度活跃，但在crhr1 KO仔鱼中未观察到这种情况。然而，进一步的实验表明，应激诱导的多动症可能主要由皮质醇的下游效应而不是CRH本身介导。对该模型的进一步研究可能揭示CRH是否独立于皮质醇调节鱼类的其他应激诱导行为，正如在啮齿动物中观察到的那样。

应激反应中CRH表达的调节：CRH的调节对于建立适当的应激反应至关重要。斑马鱼实验表明，含有同源结构域的Otp参与应激反应期间crh的转录调节。斑马鱼有两种 OTP 同源物，即 otpa 和 otpb。 otpa null斑马鱼在急性应激源暴露后不会上调crh表达。染色质免疫沉淀（ChIP）实验随后显示在暴露于应激源后Otp蛋白被招募到斑马鱼crh启动子区域。以类似的方式，Otp 在应激后也被招募到 a2bp1 基因的启动子区域。已知 RBFOX1 可调节神经元 Pac1 的可变剪接，后者编码垂体腺苷酸环化酶激活肽的受体。作者证明了短 pac1 变体是应激后 crh 转录正常上调所必需的，而 pac1-hop (long) mRNA 同种型是应激后恢复阶段 crh 转录正常终止以及内源性皮质醇的初始和恢复阶段正常调节所必需的。发现斑马鱼仔鱼pac1-hop（长）变体对于急性应激源的行为反应非常重要。这些实验支持了pac1的选择性剪接对于应激诱导的crh转录、HPA轴和行为的调节是必需的。除了在HPI轴调节的背景下鉴定似乎能急性调节crh表达的分子外，动物模型还可用于鉴定可能调节crh神经元发育的分子，而这些分子又可能影响其在HPA轴的功能。啮齿动物的经典敲除研究已经确定了参与 CRH 神经元发育调节的多个参与者。斑马鱼研究还发现了一些正在开发的新型crh潜在调节因子。趋化因子样基因 sam2 (samdori 2) 的斑马鱼突变体在新型水箱和浅滩试验测试中表现出焦虑样行为，并且视前区的 crh 表达显着增加。Sam2 KO小鼠也表现出焦虑和恐惧行为，在PVN中Sam2似乎调节CRH神经元上GABA能输入的频率。

人类应激障碍的斑马鱼模型：CRH-DISC1连接

描述人类应激障碍的最佳斑马鱼模型之一是DISC1（精神分裂症1中的紊乱）斑马鱼。DISC1编码一种多功能支架蛋白，显示出大量的蛋白质-蛋白质相互作用。有证据表明DISC1是一系列精神疾病的危险因素，并在神经发育和神经信号通路中发挥作用。尽管 DISC1 与更广泛人群中的精神疾病的相关性仍然存在争议，但 DISC1 突变体和转基因小鼠作为人类精神疾病模型具有表面有效性从而使人们了解精神疾病的病理生理机制。Disc1突变小鼠表现出广泛的行为和神经表型。其中包括HPA轴缺陷，表现为应激反应的改变。在携带可诱导突变人DISC1基因的转基因小鼠株中报道了HPA轴的反应性减弱。在第二项研究中，报告了一种相反的表型：轻度隔离应激携带突变人DISC1基因的青少年转基因小鼠后发现血浆皮质酮水平升高。这些明显相互矛盾的结果可能反映了使用不同应激模式、使用不同启动子的突变人DISC1表达谱或在HPA轴上运行的复杂反馈环的差异。在胚胎斑马鱼中，在腹侧间脑（包括下丘脑结节）disc1表达显著。表达disc1的细胞靠近表达crh的神经元，以及表达nr5a1a和pomca的神经元。纯合disc1突变体改变了下丘脑结节中crh的表达，视前下丘脑中crh表达也改变。disc1 突变的影响在生命早期是动态的：在胚胎期，在视前 NPO 区域观察到 crh 表达增加而 disc1 突变体仔鱼下丘脑中 crh 表达降低。仔鱼阶段crh表达神经元的减少与突变仔鱼对急性应激暴露的迟钝行为和内分泌反应相关，这与先前描述的HPA轴反应性减弱一致。鉴于 crh 在应激调节中的重要作用以及 disc1 突变斑马鱼应激反应的改变，disc1 似乎 通过 crh 调节 HPA 轴。disc1调节下丘脑crh神经元发育的机制尚不清楚。此外，disc1突变体显示表达pomca和nr5a1a的神经元分化发生改变。到目前为止导致disc1突变体中crh表达神经元数量改变的机制尚不清楚。迄今为止没有对斑马鱼rx3基因敲除后的rx3表现祖细胞进行谱系分析也没有对crh表现神经元进行全面分析。disc1可通过作用于已知的crh调节因子之一，如otp、arnt2和sim1a、brn2或LIM同源框2（lhx2）或通过未知途径调节crh神经元的发育。disc1 可以通过作用于已知的 crh 调节因子之一，如 otp、arnt2 和 sim1a、brn2 或 LIM 同源框 2 (lhx2) 或通过尚不清楚的途径来调节 crh 神经元的发育。

Disc1对斑马鱼下丘脑发育的调节

未来展望：最近对斑马鱼的研究表明应激反应中CRH神经元的活动是复杂的，受到严格的调节，CRH 神经元活动的不同方面会随着威胁性刺激而变化。使用体内钙成像等技术测量斑马鱼的神经元活动是梳理完整动物 CRH 神经元复杂功能的有力工具。在有或无应激源暴露的disc1突变鱼中进行钙成像，可以深入了解disc1是否在体内调节CRH神经元的活动。在不同环境（例如早期生活压力暴露）下饲养的动物的 CRH 神经元的钙成像可以揭示发育如何影响应激反应。哺乳动物的单细胞 RNA 测序 (scRNAseq) 研究表明即使在视前区域内也存在多个下丘脑 Crh 表达细胞亚群。斑马鱼是一种具有较小的大脑的简单模型生物，但具有高度的分子保守性可用于研究这些小细胞群的发育和功能。disc1 突变鱼 crh 表达细胞的 scRNAseq 可用于梳理由于 disc1 功能缺乏导致的 CRH 神经元特定的亚群差异以及鉴定连接disc1与CRH神经元发育和功能的分子。

原文出自：Zebrafish as a model to investigate the CRH axis and interactions with DISC1 - ScienceDirect