摘要：N-异丙基-N-苯基-1,4-苯二胺（IPPD）是世界范围内普遍使用的抗氧化剂，是轮胎橡胶中的添加剂，容易排放到周围环境中。目前，尚未有关于IPPD对鱼类亚急性毒性的研究。使用斑马鱼胚胎（受精后2小时）暴露于0、0.0012、0.0120和0.1200 mg/L的浓度的IPPD 5天以研究其对胚胎发育、生长激素/胰岛素样生长因子（GH/IGF）和下丘脑-垂体-甲状腺（HPT）轴的破坏的毒性效应。结果表明，IPPD暴露降低了斑马鱼的孵化率，削弱了运动能力，减少体长，并导致斑马鱼胚胎出现多种畸形。斑马鱼幼体暴露于IPPD后，GH/IGF和HPT轴相关基因的表达发生改变。同时，IPPD显著降低了仔鱼体内甲状腺素（T4）和3,5,3′-三碘甲状腺原氨酸（T3）的含量，表明HPT轴处于紊乱状态。此外，IPPD 的治疗降低了超氧化物歧化酶 (SOD) 和过氧化氢酶 (CAT) 的酶活性以及谷胱甘肽 (GSH) 的水平。而暴露于IPPD后丙二醛（MDA）的含量升高。本研究表明，IPPD诱导氧化应激，引起发育毒性，并破坏斑马鱼的GH/IGF和HPT轴，这可能导致发育障碍和生长抑制。

关键词：斑马鱼  IPPD  生长激素/胰岛素样生长因子（GH/IGF）轴  下丘脑-垂体-甲状腺（HPT）轴  氧化应激

简介：橡胶抗氧剂是添加到橡胶及其制品中的一种添加剂，具有抑制氧化、耐热或耐光、防止老化的作用，从而延长制品的贮存期和使用寿命。由于轮胎的磨损，这些抗氧化剂及其化合物很容易随路面雨水释放到水体中。相关研究报告称，当银鲑向上游迁徙并产卵时，每年有90%的鲑鱼突然死亡。如果碰巧遇到大雨，它会加快鲑鱼的死亡时间，大量鲑鱼将在短短几个小时内死亡。研究人员认为，这与轮胎生产过程中添加的抗氧剂6PPD产生的化合物N-(1,3-二甲基丁基)-N'-苯基-对苯二胺(6PPD)-醌密切相关。根据不同的标准，橡胶抗氧剂可以分为不同的种类，其中芳香族仲胺（Ar-SAs）是最常用的一种。就化学结构的变化而言，Ar SA可分为取代二苯胺（S-DPAs）和取代对苯二胺（S-PPD）。后者是橡胶工业中最有效和最常用的抗氧化剂和抗臭氧剂。N-异丙基-N-苯基-1,4-苯二胺（IPPD）和6PPD都是抗氧化剂的芳香族仲胺（Ar-SAs），也是使用最广泛的轮胎抗氧化剂。橡胶释放到废水中是非常令人担忧的，因为水载污染物会影响人类和动物的健康以及我们的自然生态系统。IPPD用作橡胶中的抗氧化剂，主要用于汽车轮胎，世界上IPPD的年产量为10000–15000吨。IPPD 的 log 辛醇-水分配系数 (log Kow) 值为 3.88，在2～16h的不同纯度水中测定了IPPD的半衰期值。很少有研究关注IPPD的毒性，其在环境中的水平尚不清楚。迄今为止，有关 IPPD 毒性的信息很少见。 没有关于人类急性吸入或口服暴露IPPD后影响的数据。在两项简要报告的研究中，大鼠经口IPPD途径具有中等毒性，而家兔经皮途径具有极低毒性。IPPD是动物和人类的皮肤致敏剂。体外哺乳动物细胞诱变试验表明，IPPD具有诱发染色体畸变的潜力。根据急性毒性结果，虹鳟鱼和黑头鲦鱼的 96 h 致死浓度 50 (LC50) 为 0.34 至 0.43 mg/L。并且没有关于 IPPD 对鱼类的亚急性影响的信息。 IPPD是否对水生生物有明显的发育毒性尚不清楚。虽然生长和发育是复杂的遗传和分子相互作用的结果，因此是各种因素的组合，但鱼类的几乎所有主要生理过程，包括能量平衡、免疫功能、繁殖以及主要生长，都受生长激素和生长激素/胰岛素样生长因子（GH/IGF）轴的调节。因此，生长激素/胰岛素样生长因子轴作为鱼类生长的关键神经内分泌调节因子引起了广泛关注。此外，甲状腺激素（THs）在体细胞生长、发育、代谢、孵化后变态和行为控制中起着至关重要的作用。甲状腺激素的合成、分泌、运输和代谢受下丘脑-垂体-甲状腺（HPT）轴的调节。众所周知，没有健康的生理功能，鱼就无法生长。 含有抗氧化酶和非酶抗氧化剂的抗氧化防御系统对鱼类的生长性能也起着重要作用。在这项研究中，斑马鱼胚胎暴露于不同浓度的 IPPD 以观察发育和生长毒性。 定量测定主要影响生长发育的GH/IGF和HPT轴所涉及的激素和基因表达的变化。并检测到参与抗氧化防御系统的抗氧化酶。 本研究的目的是研究斑马鱼抗氧化防御系统、GH/IGF 和 HPT 轴对 IPPD 暴露的反应机制。

发育毒性：IPPD 对斑马鱼的 96 小时 LC50 为 1.2 mg/L，95% 置信区间为 0.9-1.5 mg/L，根据全球化学分类和标签协调手册 (GHS) 分类标准，IPPD 对斑马鱼具有剧毒。三个暴露组的孵化率均下降，0.1200 mg/L处理组的孵化率比对照组低39.76%。

图1、暴露于 IPPD (0, 0.0012, 0.0120 和 0.1200 mg/L) 的斑马鱼（a） 48 h的孵化率、(b) 60 秒内自主运动、(c) 120 h胚胎的体长。

与对照组相比，所有 IPPD 治疗组的自发运动均显著降低，0.0012、0.0120 和 0.1200 mg/L 治疗组的自发运动分别降低了 28.5%、31.17% 和 68.5%。暴露120 h后，0、0.0012、0.0120和0.1200 mg/L的平均体长分别为4.15（ ± 0.16）、4.02（ ± 0.16）、3.85（ ± 0.10）和3.75（ ± 0.06）mm。暴露于 0.0120 和 0.1200 mg/L IPPD 后观察到显著下降。记录了IPPD引发斑马鱼幼体的畸形。与对照组相比，所有治疗组均观察到典型畸形，包括弯尾畸形（BT）、脊柱弯曲畸形（BS）和卵黄囊肿（VC）。此外，观察表明，畸形可能以一种形式出现，也可能同时以多种形式出现。

GH/IGF 轴上的基因转录谱：暴露于IPPD后，gh的转录水平（1.13、1.11和1.04倍）没有显著变化。同样，经IPPD处理后，ghrh的表达也没有显著变化。ghra 基因表达水平（0.77、0.91 和 0.57 倍）在 0.0012 和 0.1200 mg/L 处理组中下调，而 ghrb（1.68、1.58 和 1.09 倍）在 0.0012 和 0.0120 mg/L 暴露组中显著上调。

图 2、 斑马鱼胚胎暴露于 0、0.0012、0.0120 和 0.1200 mg/L IPPD 下 96 h 的 GH/IGF 轴相关基因的 mRNA 表达谱。

在三个IPPD暴露组中，igf1的表达（0.32、0.27和0.47倍）显著下调.。同样，在三个IPPD暴露组中，igf1ra（0.09、0.09和0.25倍）和igf1rb（0.12、0.11和0.68倍）的表达也显著下调。igf2a（1.17、1.00和0.68倍）和igf2b（1.15、1.07和0.57倍）的转录水平仅在0.1200 mg/L IPPD组中下调。与 igf2a 和 igf2b 类似，igf2r 的转录水平（1.25、1.18 和 0.42 倍）仅在 0.1200 mg/L IPPD 组中下调。igfbp1a（0.93、0.79和0.19倍）和igfbp1b（1.27、1.18和0.22倍）的转录水平仅在0.1200 mg/L处理组显著下调。在三个IPPD暴露组中，igfbp2a（0.33、0.44和0.48倍）和igfbp6b（0.58、0.42和0.28倍）的转录水平显著下调。igfbp5a的基因表达（0.89、1.42和1.19倍）仅在0.0120 mg/L IPPD组中上调。 IPPD对igfbp7的表达无显著影响（1.09、1.26和1.23倍）。

HPT轴基因转录谱：与对照组相比，所有暴露组的tshβ（0.69、0.59和0.53倍）和crh（0.64、0.52和0.37倍）基因均呈浓度依赖性下调。

图 3 、斑马鱼胚胎暴露于 0、0.0012、0.0120 和 0.1200 mg/L 的IPPD 96 h 时，HPT 轴相关基因的 mRNA 表达谱。暴露于 0.0012 mg/L 和 0.1200 mg/L IPPD 显著上调 dio2 的表达（1.30、1.17 和 1.31 倍）。同样，三个 IPPD 暴露组中，tr α（0.54、0.49 和 0.38 倍）和 tr β（0.55、0.46 和 0.40 倍）的表达显著下调。

GH和IGF含量：与对照组相比，三个IPPD治疗组的GH激素水平显著降低。同样，与对照组相比，暴露于IPPD显著降低IGF的激素水平。仔鱼暴露120小时后测量全身THs水平。 各治疗组T3、T4总水平呈下降趋势。同时，与对照组相比，所有暴露组的T3与T4比率均显著降低。

图4、 暴露于0、0.0012、0.0120和0.1200mg/L的IPPD直至120 hpf斑马鱼仔鱼GH（a）和IGF（b）激素水平

图5、（a） 甲状腺素（T4）含量；（b） 3,5,30-三碘甲状腺原氨酸（T3）含量；（c） 暴露于0、0.0012、0.0120和0.1200mg/L的IPPD直至120 hpf斑马鱼仔鱼的T3/T4比值。

氧化应激：暴露于 IPPD 会导致 MDA 和 GSH 水平以及 SOD 和 CAT 的酶活性发生显著变化。与对照组相比，所有治疗组的SOD活性均呈剂量依赖性下调，CAT活性均显著下调。三个治疗组的MDA含量均有不同程度的升高。 而0.0012和0.0120 mg/L组GSH含量较对照组降低。

图 6. 暴露于 0、0.0012、0.0120 和 0.1200 mg/L IPPD 直至 120 hpf 的斑马鱼仔鱼 SOD (a)、CAT (b) 和 MDA (c)、GSH (d) 水平的变化。

讨论：IPPD对生物体的毒性尚不清楚。根据几项简短的研究，IPPD对大鼠具有中等毒性，对家兔具有极低毒性。IPPD是动物和人类的皮肤敏化剂，有可能诱发哺乳动物细胞染色体畸变。根据鱼类的急性毒性结果，IPPD对蓝鳃太阳鱼、虹鳟和黑头鲤具有高度毒性。目前没有关于IPPD对鱼类亚急性影响的信息。在本研究中，我们在实验室条件下评估了IPPD对斑马鱼胚胎-仔鱼生长发育阶段的影响。对孵化率和体长有显著影响，这表明胚胎发育直接延迟。自发运动是肌肉和运动神经系统共同发育的结果，是评估化学品对鱼类毒性的重要毒理学终点。我们还检测到仔鱼的自发运动减少。 因此，IPPD 暴露后自发运动的浓度依赖性减少可能意味着由于 IPPD 潜在的神经发育毒性而导致的发育迟缓。 需要进一步的调查来证实这一观察结果。多种环境化学物质，如金属元素、纳米颗粒、持久性有机污染物、杀虫剂，均可诱发脊柱弯曲等骨骼异常。脊柱畸形可能是由于健康肌肉骨骼系统发育所必需的肌节和/或肌球蛋白形成减少所致。在本研究中，IPPD引起的畸形可能是一种或多种机制的结果。由于确定畸形的机制不是本研究的目标，因此需要进一步的研究来调查它们。

暴露于IPPD的GH/IGF轴反应：在我们的研究中，暴露于IPPD后，仔鱼的体长受到显著抑制，这表明IPPD影响了仔鱼的生长性能。生长激素/胰岛素样生长因子轴在鱼类生长的内分泌调节中起主导作用。初始阶段 GH/IGF 轴的任何缺陷都可能对鱼类的生长产生永久性影响。 这种在脊椎动物发育早期形成的复杂生长系统主要由配体、受体和一些具有高亲和力的结合蛋白组成。GH/IGF 轴由配体（胰岛素样生长因子-I、胰岛素样生长因子-II）、受体（胰岛素样生长因子-IR、胰岛素样生长因子-ⅡR）和胰岛素样生长因子结合蛋白（胰岛素样生长因子结合蛋白）组成，以协调的方式调节几乎所有细胞类型的增殖、分化和存活。GH/IGF 轴在调节鱼类的体细胞生长和孵化后发挥着至关重要的作用，被认为是环境污染物影响的指标。我们检测了GH/IGF轴相关基因的表达。生长激素通过与肝脏中的生长激素受体 (GHR) 结合来刺激 IGF 的合成和释放。 斑马鱼有两种主要的 GHR（ghra 和 ghrb）。gh 的表达影响两种特定受体（ghra 和 ghrb）的表达。gh的表达没有明显变化，而ghra的表达明显下调。 因此，ghrb的表达上调，以弥补ghra的不足，维持受体的平衡。生长激素释放激素（ghrh）是促进垂体分泌GH的最重要的神经内分泌因子。 ghrh的表达没有显著变化，表明ghrh可能不促进gh的表达。IGFs家族，包括IGFI和IGFII，是脊椎动物中进化上保守的肽，通过保守的信号通路发挥作用。斑马鱼基因组包含哺乳动物IGF2的两个同源物（igf2a和igf2b）。这些IGFs参与细胞生长和代谢，IGFs的生物活性和生物利用度受IGFBPs调控。IGFBPs对IGFs的亲和力高于对IGFRs的亲和力。 IGFBP家族有6个成员，包括IGFBP1-IGFBP6。 哺乳动物通常有六种 IGFBP，而其他一些物种则缺乏其中的一种或多种。例如，鸡和斑马鱼没有 IGFBP 4 基因。在我们的研究中，IGFs（igf1、igf2a和igf2b）基因和IGF蛋白水平以及IGFR（igf1ra、igfrb和igf2r）的下调可能是IGFBPs（igfbp2a、igfbp1a和igfbp6b）下调的结果。IGFBPs通过影响IGF的转运而影响IGF的正常水平和生理功能，从而导致生长发育受损。我们使用qRT PCR检测IGFBPs（igfbp1b、igfbp2a、igfbp6b、igfbp1a、IGFBP7和igfbp5a）的表达。其中igfbp2a、igfbp6b和igfbp1a显著下调，igfbp7和igfbp5a轻微上调。IGFBP-1是一种与IGF结合的分泌蛋白，在调节体细胞的生长、发育和衰老中起着至关重要的作用。qRT-PCR结果表明斑马鱼中igfbp1a的转录水平显著下调，表明IPPD暴露后斑马鱼的生长发育受到抑制。斑马鱼IGFBP-2是一种对IGF-I和IGF-II（而非胰岛素）具有高度亲和力的基因编码蛋白，在体外可抑制IGF诱导的细胞生长。本研究中观察到的igfbp2a的显著下调表明IPPD对斑马鱼的早期胚胎发育造成不利影响。研究表明，IGFBP6s（igfbp6a和igfbp6b）是一种抑制性蛋白质，可能通过结合IGF抑制IGF在体内的作用。在我们的研究中，igfbp6b转录水平的下调可能会影响IGF的正常功能。我们的结果表明，暴露于IPPD后，参与GH/IGF轴的基因表达受到干扰，这可能导致斑马鱼胚胎的生长抑制。

暴露于IPPD的HPT轴响应：在脊椎动物中，除GH/IGF轴外，HPT轴在生长发育过程中也起着重要作用，负责维持正常的甲状腺激素浓度。HPT轴功能的改变会影响新陈代谢、渗透调节和发育。在本研究中，暴露于IPPD后，斑马鱼仔鱼的全身THs（T4和T3）水平降低。我们的结果表明，暴露于IPPD可干扰体内甲状腺激素。IPPD破坏了斑马鱼仔鱼的甲状腺系统。qRT-PCR检测HPT轴相关基因的表达。甲状腺滤泡中T4和T3的合成和释放受垂体促甲状腺激素（tsh）的控制。在哺乳动物中，促甲状腺素释放激素（trh）或促肾上腺皮质激素释放激素（crh）是tsh的主要调节者，而在硬骨鱼中，tsh的分泌由crh调节。因此，crh和tshβ的下调可能与甲状腺激素含量降低有关。因此，本研究中观察到的仔鱼全身总甲状腺激素（T4和T3）含量的降低可能是由于crh和tshβ表达下调所致。碘甲状腺原氨酸脱碘酶 (dios) 负责甲状腺激素的激活和失活，甲状腺激素在脊椎动物的循环和外周 THs 水平中起着关键调节作用。以往的研究表明，脱碘酶的转录水平是暴露于环境污染物的鱼类甲状腺破裂的敏感分子生物标记物。THs在维持脊椎动物的正常生理活动中发挥着重要作用，THs与肝脏、眼睛和生殖器官等各种器官中的甲状腺激素受体（thrα和thrβ）结合并激活，从而诱导生理活动和行为。我们的研究结果表明，在不同浓度的 IPPD 处理后，thrα 和 thrβ 的表达水平显著下调，这可能会导致斑马鱼仔鱼的生长抑制和发育障碍。氧化应激也会影响水生生物的生长、生存和发育。抗氧化防御系统由酶和非酶成分组成。 酶系统包括超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶 (CAT) 和谷胱甘肽过氧化物酶 (GPx)，而还原型谷胱甘肽 (GSH) 是重要的非酶抗氧化剂之一。SOD和CAT活性的显著降低表明，暴露于IPPD后，斑马鱼仔鱼体内活性氧（ROS）和抗氧化系统之间的平衡被破坏。谷胱甘肽是一种重要的抗氧化剂，其含量可以反映细胞器的抗氧化能力。谷胱甘肽含量的显著降低表明抗氧化剂的过度消耗，因此导致抗氧化防御能力的显著降低。MDA是脂质过氧化的主要氧化产物。 本研究中 MDA 生成的增加表明，暴露于 IPPD 后可诱导氧化应激。 鉴于氧化应激与生长性能之间的关系，可以推断氧化应激是IPPD对生长的毒性作用之一。

结论：我们的研究表明，暴露于IPPD的斑马鱼胚胎表现出明显的生长抑制，并改变了GH/IGF的激素含量以及GH/IGF和HPT轴相关基因的表达水平。我们可以推断，IPPD 诱导的生长抑制是由 GH/IGF 和甲状腺内分泌系统破坏的综合作用造成的。此外，IPPD的处理显著影响斑马鱼胚胎的抗氧化状态，其机制需要进一步研究。鉴于IPPD作为橡胶抗氧化剂的广泛使用，其残留物存在于环境中，需要进一步研究，以评估IPPD单独或与其他化学品组合使用对鱼类的长期影响。

原文出自：IPPD-induced growth inhibition and its mechanism in zebrafish - ScienceDirect